Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate

Summary

Invecchiamento cronologico di lievito si riferisce alla perdita di vitalità cellulare associato con il tempo in fase stazionaria. Qui si descrivono un elevato throughput metodo per determinare quantitativamente la durata della vita cronologico lievito.

Abstract

Il lievito in erba<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Ha dimostrato di essere un organismo modello importante nel campo della ricerca sull'invecchiamento¹. La replicazione e la durata della vita cronologico sono due paradigmi stabiliti utilizzato per studiare l'invecchiamento nel lievito. Invecchiamento replicativo è definito come il numero di cellule figlie una sola cellula madre lievito produce prima di senescenza, invecchiamento cronologico è definito dalla lunghezza delle cellule tempo può sopravvivere in un non-divisione, quiescenza stato simile². Abbiamo sviluppato un elevato throughput metodo per la misurazione quantitativa della durata cronologica. Questo metodo comporta l'invecchiamento delle cellule in un mezzo definito sotto agitazione ea temperatura costante. Ad ogni età-point, una sotto-popolazione di cellule viene rimosso dalla cultura invecchiamento e inoculati in terreno di coltura ricco. Ad alta risoluzione curva di crescita è quindi ottenuto per questa sotto-popolazione di cellule invecchiate con una macchina Bioscreen C MBR. Un algoritmo viene poi applicata per determinare la percentuale relativa di cellule vitali in ogni sub-popolazione basata sulla cinetica di crescita ad ogni età-point. Questo metodo richiede meno tempo e risorse rispetto ad altri saggi cronologico durata della vita, pur mantenendo la riproducibilità e precisione. L'high-throughput natura di questo test dovrebbe consentire schermi genetiche e chimiche su larga scala per identificare i modificatori longevità romanzo per ulteriori test in organismi più complessi.

Protocol

Parte 1: Preparazione delle colture invecchiamento Ceppi striscia di interesse da parte scorte congelate su piastre di agar YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% agar, 2% di glucosio). Incubare le cellule a 30 ˚ C per 48 ore o fino a singole colonie appaiono. Scegli singole colonie e inoculare in 5 ml di liquido YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% di glucosio) in provetta. Grow culture notte a 30 ˚ C, mantenendo costante agitazione utilizzando uno sh…

Discussion

L'high-throughput vita saggio arco cronologico qui descritto è un metodo efficace per quantificare il potenziale di invecchiamento di un gran numero di ceppi con elevata accuratezza e precisione. L'anticipo principale di questo metodo rispetto ai metodi classici per stabilire la sopravvivenza contando unità formanti colonie (ad esempio vedi ³⁾ è l'uso di un dispositivo di lettura shaker / incubatore / piastra, come la macchina Bioscreen C MBR di ottenere alta risoluzione curve di crescita a ogn…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Bacto Peptone	Reagent	BD	211677
Bacto Yeast Extract	Reagent	BD	288620
Difco Agar	Reagent	BD	214530
Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.	Reagent	MidSci	J630-500G
Amino Acids	Reagent	Sigma
Ammonium Sulfate	Reagent	Spectrum	AM185
Dextrose	Reagent	Fisher	D16-10
Bioscreen C MBR machine	Tool	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100-well Honeycomb plate	Tool	Growth Curves USA	9502550