Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 2
Summary
Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.
Abstract
La famille<em> Poxviridae</em> Se compose de grandes double-brin d'ADN contenant des virus qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de la<em> Orthopoxvirus</em> Genre comprennent la variole, l'agent causal de la variole humaine, simienne, et la vaccine (ACC), le membre prototypique de la famille des virus. Dans le génome relativement importante (~ 200 ko) de la vaccine, trois classes de gènes sont encodés: précoce, intermédiaire et tardive. Alors que tous les trois classes sont transcrits par les ARN polymérases virale codée, chaque classe a une fonction différente dans le cycle de vie du virus. Les poxvirus utilisent de multiples stratégies pour la modulation de l'environnement cellulaire de l'hôte pendant l'infection. Afin de comprendre la régulation de l'hôte et l'expression des gènes du virus, nous avons utilisé l'échelle du génome des approches pour analyser l'abondance transcription de deux virus et les cellules hôtes. Ici, nous démontrons infections cours du temps des cellules HeLa par le virus de la vaccine et de l'ARN d'échantillonnage à différents moments après l'infection. Les deux hôtes et virales ARN total est isolé et amplifié pour que l'hybridation des puces pour l'analyse de l'expression génique.
Protocol
Discussion
Étapes critiques
Un second tour de l'amplification n'est pas conseillé que des biais dans les données array ont été observées. Mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique (1 er et 2 ème synthèse brin d'ADNc, IVT) est essentielle à l'obtention de rendements d'amplification bon, tout comme l'incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un cycleur PCR avec couvercle chauffant réglable est préféré – les …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Fonds
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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