Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2
Summary
פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 2 מתוך 3.
Abstract
המשפחה<em> Poxviridae</em> מורכב גדילי הדנ"א הכפול גדולים המכילים וירוסים לשכפל אך ורק בציטופלסמה של תאים נגועים. חברי<em> Orthopox</em> הסוג כולל אבעבועות, הסוכן סיבתי של אבעבועות קטנות האדם, הקוף, ואת vaccinia (VAC), חבר prototypic משפחת וירוסים. בתוך גדולות יחסית (~ 200 kb) vaccinia הגנום, שלוש כיתות של גנים המקודדים: מוקדם, ביניים מאוחר. בעוד כל שלוש כיתות מתועתקים ידי virally בקידוד polymerases RNA, כל שיעור מהווה פונקציה שונה במחזור החיים של הנגיף. Poxviruses לנצל אסטרטגיות מרובים עבור אפנון של הסביבה המארחת הסלולר במהלך ההדבקה. כדי להבין את הרגולציה של המארח וגם גן ביטוי וירוס, יש לנו מנוצל הגנום כולו גישות לנתח שפע תמליל מנגיף וגם התאים המארחים. הנה, אנחנו מדגימים כמובן זמן זיהומים של תאים הלה בווירוס Vaccinia ו-RNA הדגימה במספר נקודות זמן לאחר הפגיעה. מארח שני ו-RNA ויראלי הכולל מופרד מוגבר של הכלאה כדי microarrays עבור ניתוח של ביטוי גנים.
Protocol
Discussion
קריטי שלבים
בסיבוב השני של הגברה לא מומלץ, היות הטיות נתונים מערך נצפו. ערבוב בזהירות בכל שלב האנזימטית (1 st ו – 2 nd סינתזת גדיל cDNA, IVT) הוא קריטי להשגת תשואות הגברה טובה, כמו דגירה של כל צעד האנזימטית בטמפרטורה המתאימה. Cycler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
וייטהד במכון עמיתי קרנות
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
