Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2
Summary
Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 2 di 3.
Abstract
La famiglia<em> Poxviridae</em> È costituito da grandi DNA a doppia elica che contiene virus che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri del<em> Orthopox</em> Genere includono vaiolo, l'agente eziologico del vaiolo umano, vaiolo delle scimmie, e vaccinico (VAC), il membro prototipo della famiglia di virus. All'interno del relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, tre classi di geni sono codificati: precoce, intermedio e in ritardo. Anche se tutte e tre le classi sono trascritte dai virale codifica RNA polimerasi, ogni classe svolge una funzione diversa nel ciclo di vita del virus. Poxvirus utilizzano strategie multiple di modulare l'ambiente host cellulare durante l'infezione. Per capire regolamentazione sia di accoglienza e di espressione genica del virus, abbiamo utilizzato tutto il genoma approcci per analizzare abbondanza trascrizione sia da virus e cellule ospiti. In questo studio dimostriamo infezioni corso a tempo di cellule HeLa con il virus vaccinico e RNA di campionamento in diversi momenti dopo l'infezione. Sia host e virale RNA totale è isolato e amplificato per l'ibridazione di microarray per l'analisi dell'espressione genica.
Protocol
Discussion
Passaggi critici
Un secondo ciclo di amplificazione non è consigliato come pregiudizi nei dati di serie sono stati osservati. Mescolando con cura in ogni fase enzimatica (1 ° e 2 ° sintesi filamento cDNA, IVT) è fondamentale per ottenere buoni rendimenti amplificazione, così come di incubazione di ogni passo enzimatica a temperatura adeguata. Un cycler PCR con regolabile coperchio riscaldato si preferisce – deviazioni anche il più piccolo 2-3 gradi durante IVT in un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Fondi
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
