Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2
Summary
Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.
Abstract
De familie<em> Poxviridae</em> Bestaat uit grote double-stranded DNA die virussen bevatten die uitsluitend repliceren in het cytoplasma van de geïnfecteerde cellen. De leden van de<em> Orthopoxvirus</em> Genus behoren variola, de verwekker van de menselijke pokken, apenpokken, en vaccinia (VAC), het prototype lid van het virus familie. Binnen de relatief grote (~ 200 Kb) vaccinia genoom, zijn drie klassen van genen gecodeerd: vroege, intermediaire en late. Terwijl alle drie de klassen zijn getranscribeerd door viraal gecodeerde RNA-polymerasen, elke klas heeft een ander functie in de levenscyclus van het virus. Poxviruses gebruik van meerdere strategieën voor modulatie van de host-cellulaire omgeving tijdens de infectie. Met het oog op regulering van zowel de gastheer en virus genexpressie te begrijpen, hebben we gebruik gemaakt genoom-brede aanpak van transcript overvloed analyseren van zowel virus en gastheercellen. Hier laten we zien tijdsverloop infecties van de HeLa cellen met Vaccinia virus en bemonstering RNA op verschillende tijdstippen na infectie. Zowel de host-en virale totaal RNA wordt geïsoleerd en versterkt voor hybridisatie met microarrays voor de analyse van genexpressie.
Protocol
Discussion
Kritische stappen
Een tweede ronde van de versterking wordt afgeraden als vooroordelen in array data zijn waargenomen. Het mengen van zorgvuldig bij elke enzymatische stap (1 e en 2 e streng cDNA synthese, IVT) is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een goede versterking opbrengst, net als incubatie van elk enzymatische stap voor stap de juiste temperatuur. Een PCR cycler met verstelbare verwarmde deksel heeft de voorkeur – zelfs afwijkingen zo klein als 2-3 grade…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows fondsen
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
