بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 2 من 3.
Abstract
الأسرة<em> Poxviridae</em> تتكون من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الكبيرة التي تحتوي على الفيروسات التي تحاكي حصرا في السيتوبلازم من الخلايا المصابة. أعضاء<em> الجدري</em> جنس تتضمن الجدري ، والعامل المسبب للجدري الصغيرة الإنسان ، والقرود ، والوقس (VAC) ، وعضو من عائلة prototypic الفيروس. داخل الجينوم الوقس كبيرة نسبيا (~ 200 كيلوبايت) ، يتم ترميز ثلاثة أنواع من الجينات : في وقت مبكر ، وسيطة ، والمتأخر. بينما كتب جميع الطبقات الثلاث polymerases RNA فيروسي ترميز ، ولكل فئة يؤدي وظيفة مختلفة في دورة حياة الفيروس. Poxviruses استخدام استراتيجيات متعددة لتعديل البيئة المضيفة الخلوي أثناء العدوى. من أجل فهم كل من استضافة وتنظيم التعبير الجيني والفيروسات ، واستخدمت على نطاق ونحن الجينوم النهج لتحليل النص وفرة من كل الفيروسات والخلايا المضيفة. هنا ، علينا أن نظهر للالتهابات دوام خلايا هيلا مع فيروس الوقس وأخذ عينات الحمض النووي الريبي في الوقت عدة نقاط في مرحلة ما بعد الإصابة. يتم عزل كل من الحمض النووي الريبي مجموع المضيفة والفيروسية وتضخيم للتهجين لميكروأرس لتحليل التعبير الجيني.
Protocol
الجزء 1 : [كدنا] تجميع من الحمض النووي الريبي قبل استخدام Ambion الأمينية الآليل MessageAmp الثاني عدة ، إضافة الحجم الموصى بها من الإيثانول بنسبة 100 ٪ للمخازن الغسيل. في أنبوب تفاعل PCR ، إضافة إلى 5μg ب…
Discussion
خطوات حاسمة
لا ينصح الجولة الثانية من التضخيم كما لوحظت التحيز في البيانات صفيف. الاختلاط في كل خطوة بعناية الأنزيمية (1 و 2 ش التوليف حبلا الثانية [كدنا] ، IVT) أمر حاسم للحصول غلة جيدة التضخيم ، كما هو احتضان كل خطوة الأنز…
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2. J. Vis. Exp. (26), e1169, doi:10.3791/1169 (2009).