Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2
Summary
Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.
Abstract
La familia<em> Poxviridae</em> Se compone de grandes de doble cadena de ADN que contienen los virus que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de la<em> Orthopox</em> Género incluyen la viruela, el agente causante de la viruela humana, viruela de los monos, y la vaccinia (VAC), el miembro prototípico de la familia del virus. En el genoma relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia, tres clases de genes están codificados: temprana, intermedia y tardía. Mientras que las tres clases son transcritos por la forma viral codificada ARN polimerasas, cada clase tiene una función diferente en el ciclo de vida del virus. Poxvirus utilizar múltiples estrategias para la modulación del ambiente celular del huésped durante la infección. Con el fin de entender la regulación de host y la expresión de genes del virus, hemos utilizado todo el genoma enfoques para analizar la abundancia de transcripción de los dos virus y las células huésped. Aquí, demostramos las infecciones tiempo del curso de las células HeLa con virus de la vacuna y el ARN de muestreo en varios puntos temporales después de la infección. Tanto del huésped como del ARN viral total es aislado y amplificado por la hibridación de microarrays para el análisis de la expresión génica.
Protocol
Discussion
Los pasos críticos
Una segunda ronda de amplificación no se recomienda como sesgos en la matriz de datos se han observado. Mezclando con cuidado en cada paso enzimático (1 º y 2 º capítulo de síntesis de cDNA, IVT) es fundamental para obtener buenos rendimientos de amplificación, ya que es la incubación de cada paso enzimático a la temperatura adecuada. Un termociclador de PCR con tapa térmica ajustable se prefiere – incluso desviaciones tan pequeñas como 2-3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los becarios del Instituto Whitehead Fondos
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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