Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2
Summary
Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.
Abstract
Die Familie<em> Poxviridae</em> Besteht aus großen doppelsträngigen DNA-Viren enthalten, die ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zellen replizieren. Die Mitglieder des<em> Orthopox</em> Gattung gehören Variola, dem Erreger der menschlichen Pocken, Affenpocken und Vaccinia (VAC), der prototypische Mitglied der Virus-Familie. Innerhalb der relativ groß (~ 200 kb) Vaccinia-Genom gibt drei Klassen von Genen kodiert: frühe, mittlere und spät. Während alle drei Klassen von viral-kodierten RNA-Polymerasen transkribiert werden, dient jede Klasse eine andere Funktion im Lebenszyklus des Virus. Pockenviren nutzen mehrere Strategien zur Modulation der zellulären Umgebung Host während der Infektion. Um Regulierung der Wirt und Virus Genexpression verstehen, müssen wir genomweite Ansätze genutzt werden, um Transkript Fülle von beiden Viren und Wirtszellen zu analysieren. Hier zeigen wir, zeitlicher Verlauf Infektionen von HeLa-Zellen mit Vaccinia-Virus und Sampling-RNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Beide Gastgeber und virale RNA isoliert und verstärkt für die Hybridisierung an Microarrays zur Analyse der Genexpression.
Protocol
Discussion
Kritische Schritte
Eine zweite Runde der Amplifikation wird nicht empfohlen, da Verzerrungen in Array-Daten beobachtet wurden. Mischen sorgfältig an jedem enzymatischen Schritt (1 st und 2 nd cDNA-Synthese, IVT) ist entscheidend für die Erzielung einer guten Verstärkung liefert, wie die Inkubation von jedem enzymatischen Schritt bei der entsprechenden Temperatur. Ein PCR-Cycler mit verstellbaren beheizten Deckel wird bevorzugt – auch Abweichungen so klein wie 2-3 Grad …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Funds
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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