Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.
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Methodenartikel
Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Familie
Protokoll
Teil 1: cDNA-Synthese aus RNA
- Vor der Verwendung der Ambion Amino Allyl MessageAmp II Kit, fügen Sie die empfohlene Menge von 100% Ethanol zu dem Waschpuffer.
- In PCR-Gefäß, fügen Sie zwischen 100 ng bis 5μg Gesamt-RNA und 1μl der T7-Oligo (dT)-Primer. Bringen Sie die Lautstärke von bis zu 12μl mit Nuklease-freiem Wasser.
- Inkubieren Proben bei 70 ° C für 10 min in einem Thermocycler.
- Entfernen RNA-Proben von 70 ° C und kurz zentrifugieren. Auf Eis legen.
- Bereiten Sie die 1. Strand Synthesis Master-Mix und halten bei Raumtemperatur (mit 10% Überschuss zum Pipettieren Fehler). (Tabelle 1)
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Diskussion
Kritische Schritte
Eine zweite Runde der Amplifikation wird nicht empfohlen, da Verzerrungen in Array-Daten beobachtet wurden. Mischen sorgfältig an jedem enzymatischen Schritt (1 st und 2 nd cDNA-Synthese, IVT) ist entscheidend für die Erzielung einer guten Verstärkung liefert, wie die Inkubation von jedem enzymatischen Schritt bei der entsprechenden Temperatur. Ein PCR-Cycler mit verstellbaren beheizten Deckel wird bevorzugt - auch Abweichungen so klein wie 2-3 Grad wäh.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Whitehead Institute Fellows Funds
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA-Amplifizierungs-Kit | Reagenz | Applied Biosystems | AM1753 | Für 20 Reaktionen |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA-Amplifizierungs-Kit | Reagenz | Applied Biosystems | AM1821 | Für 100 Reaktionen, im 96-Loch-Format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS-Spektrophotometer | Sonstiges | NanoDrop | ND-1000 | Oder gleichwertiges Spektrophotometer |
Referenzen
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickso....
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Nachdrucke und Genehmigungen
