Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm 2
Abstract
Aile<em> Poxviridae</em> Sadece enfekte hücrelerin sitoplazmasında çoğaltmak virüsler içeren büyük çift iplikli DNA oluşur. Üyeleri<em> Orthopox</em> Cinsine dahil variola, insan küçük çiçeği etkeni, monkeypox ve vaccinia (VAC), virüs aile prototipik üyesi. Göreceli olarak büyük (~ 200 kb) vaccinia genom içinde gen üç sınıfa kodlanır: erken, orta ve geç. Her üç sınıf, viral kodlanmış RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu olsa da, her sınıf, virüsün yaşam döngüsü içinde farklı bir fonksiyon sunar. Poxviruses enfeksiyon sırasında ev sahibi hücresel ortamı modülasyonu için çoklu stratejiler kullanmaktadır. Hem ev sahibi hem virüs gen ekspresyonu düzenlenmesi anlamak için, biz, hem virüs ve konak hücrelerine transkript bolluk analiz etmek için genom yaklaşımlar kullanılmaktadır. Burada, birkaç saat sonrası enfeksiyon Vaccinia virüs ve örnekleme RNA HeLa hücrelerinde zaman ders enfeksiyonları göstermektedir. Her iki konak ve viral toplam RNA gen ekspresyonu analizi için mikroarray'ler hibridizasyon için izole edilmiş ve yükseltilir.
Protocol
Bölüm 1: RNA cDNA sentezi Ambion Amino Allyl MessageAmp II kiti kullanmadan önce, yıkama tamponlar Önerilen miktar,% 100 etanol ekleyin. PCR reaksiyonu tüp, T7 oligo (dT) astar toplam RNA ve 1μl 5μg 100ng arasında ekleyin. Nükleaz içermeyen su ile 12μl hacim kazandırın. 70 numune inkübe ° C bir termalcycler 10 dk. 70 ° C ve santrifüj kısaca RNA örnekleri çıkarın. Buz üzerine yerleştirin. 1. Strand Sentez ana karışımı hazırlayın …
Discussion
Kritik Adımlar
Dizi veri önyargıları gözlenmiştir olarak ikinci bir tur amplifikasyon tavsiye edilmez. (1. ve 2. iplikçik cDNA sentezi, IVT) enzimatik her adım dikkatle Karıştırma her enzimatik adım inkübasyon uygun sıcaklık, iyi amplifikasyon verimi elde etmek için kritik öneme sahiptir. IVT sırasında 2-3 derece bir hava hibridizasyon fırın veya su banyosu hibridizasyon gibi küçük amplifiye ürün verimi önemli ölçüde etkileyebilir bile sapmal…
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2. J. Vis. Exp. (26), e1169, doi:10.3791/1169 (2009).