طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة
Summary
نحن تقديم<em> في المختبر ،</em> اللونين مقايسة مضان لتصور اندماج جزيئات فيروس واحد مع طبقة ثنائية الهدف السوائل. وذلك عبر تسمية الجسيمات الفيروسية مع fluorophores أن صمة بالتفاوت في الغشاء الفيروسية وباطنها ، ونحن قادرون على رصد حركية hemifusion وتشكيل المسام.
Abstract
الانصهار الغشاء هو خطوة أساسية أثناء دخول الفيروسات يلفها في الخلايا. المقايسات التقليدية الانصهار التقرير عادة على عدد كبير من الأحداث الانصهار ، مما يجعل من الصعب تحليلها كميا تسلسل الخطوات الجزيئية المعنية. طورنا في المختبر ، وهما لونا مقايسة مضان لرصد حركية من جسيمات فيروس واحد الصمامات مع طبقة ثنائية الهدف على دعم السوائل أساسا.
يتم تحضين جزيئات الأنفلونزا الفيروسية مع fluorophore a الأخضر لمحبة للدهون وصمة عار في الغشاء وfluorophore ماء حمراء لصبغ الداخلية الفيروسية. نحن إيداع طبقة ثنائية الدهن غانغليوزيد المحتوية على سطح الزجاج ديكستران – functionilized خلية تدفق الجزيئات الفيروسية احتضان على طبقة ثنائية مستو وصورة مضان من 100 × 100 مساحتها 2 ميكرون ، تحتوي على عدة مئات من الجزيئات ، على اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا. بواسطة التصوير كلا من مضان أحمر وأخضر ، ويمكننا رصد سلوك واحد للصباغة غشاء (الخضراء) والمحتوى المائي (أحمر) من الجسيمات.
على خفض درجة الحموضة إلى قيمة أقل من الرقم الهيدروجيني الانصهار ، سوف تندمج مع جزيئات الغشاء. Hemifusion ، ودمج المنشور في الغشاء الخارجي الفيروسية مع النشرة الخارجي للغشاء الهدف ، وسوف تكون واضحة على أنه تغيير مفاجئ في مضان أخضر من الجسيمات. وبناء على الاندماج اللاحقة للمنشورات two القاصي المتبقية يتم تشكيل المسام ، وسوف يتم الافراج عن fluorophore الحمراء التي تنبعث منها في الجسيمات الفيروسية تحت غشاء الهدف. هذا الحدث سوف تؤدي إلى انخفاض في مضان أحمر من الجزيئات الفردية. أخيرا ، ومضان متكاملة من fluorophore الحموضة حساسة مضمن في غشاء الهدف تقارير عن الوقت المحدد لانخفاض الرقم الهيدروجيني.
من آثار مضان وقت الثلاث يمكن ، الآن كل الأحداث الهامة (انخفاض درجة الحموضة ، واختلاط الدهون على المحتوى ، وعند خلط hemifusion تشكيل مسام) يمكن استخراجها بطريقة مباشرة ومنفردة لكل جسيم. من خلال جمع العصر المنقضي لالتحولات المختلفة للكثير من الجزيئات الفردية في رسوم بيانية ، يمكننا تحديد أعمار وسيطة من المقابلة. يمكن أن تكون وسيطة حتى الخفية التي لم يكن لديك تصور يمكن ملاحظتها مباشرة الفلورسنت مباشرة من هذه المدرج الاحصائي.
Protocol
Discussion
ويمكن إعداد السوائل والدهون طبقات ثنائية مستمرة بدعم أمرا صعبا. وكميات ضئيلة من المواد الملوثة أو عيوب السطح منع انتشار طبقات ثنائية. تنظيف دقيق وترسب طبقة موحدة من ديكستران ضرورية.
يمكن التصوير لفترة طويلة من جزيئات الفيروس الت…
Acknowledgements
وأيد عمل المعاهد الوطنية للصحة منح AI57159 (لSCH) وAI72346 (لAMvO). SCH هو هوارد هيوز الطبي محقق المعهد.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
