Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula
Summary
Nós apresentamos um<em> In vitro,</em> Duas cores-ensaio de fluorescência para visualizar a fusão de partículas do vírus de solteiro com uma bicamada alvo fluido. Ao classificar partículas virais com fluoróforos que diferencialmente mancha a membrana viral e no seu interior, somos capazes de monitorar a cinética de hemifusão e formação de poros.
Abstract
Fusão de membrana é um passo essencial durante a entrada de vírus encapsulados dentro das células. Ensaios de fusão convencionais tipicamente relatório sobre um grande número de eventos de fusão, tornando-se difícil analisar quantitativamente a seqüência de passos moleculares envolvidos. Nós desenvolvemos uma in vitro, duas cores-ensaio de fluorescência para monitorar cinética de fusão única partículas do vírus com uma bicamada destino em um apoio essencialmente fluido.
Partículas de gripe viral são incubados com um fluoróforo verde lipofílico para manchar a membrana e um fluoróforo vermelho hidrofílico para manchar o interior viral. Nós depositamos uma bicamada lipídica contendo gangliosídeo na superfície do vidro dextran-functionilized de uma célula de fluxo, incubar as partículas virais na bicamada planar e imagem da fluorescência de 100 x 100 mm 2 de área, contendo várias centenas de partículas, em um CCD câmera. Por imagem tanto a fluorescência vermelha e verde, podemos monitorar simultaneamente o comportamento do corante de membrana (verde) e do conteúdo aquoso (vermelho) das partículas.
Após a redução do pH para um valor abaixo do pH de fusão, as partículas irão fundir com a membrana. Hemifusão, a fusão do folheto externo da membrana viral com o folheto externo da membrana-alvo, será visível como uma mudança súbita na fluorescência verde de uma partícula. Após a fusão subseqüente dos dois restantes folhetos distal de um poro será formado eo fluoróforo vermelho-emitting na partícula viral será lançado sob a membrana alvo. Este evento dará origem a uma diminuição da fluorescência vermelha de partículas individuais. Finalmente, a fluorescência integrada a partir de um fluoróforo pH-sensíveis que está incorporado na membrana-alvo relatórios sobre o momento exato da queda de pH.
Do três-tempo de fluorescência traços, todos os eventos importantes (queda de pH, lipídios mistura no conteúdo hemifusão, misturando sobre a formação de poros) podem agora ser extraídas de uma maneira direta e para cada partícula individualmente. Coletando os tempos decorridos para várias transições para muitas partículas individuais em histogramas, podemos determinar a vida útil dos intermediários correspondentes. Mesmo intermediários ocultos que não têm um observáveis direta fluorescentes podem ser visualizados directamente a partir destes histogramas.
Protocol
Discussion
Preparação de fluido e contínuo bicamadas lipídicas suportados pode ser um desafio. Traços de contaminação defeitos de material ou superfície vai evitar a propagação de bicamadas. Limpeza cuidadosa e deposição de uma camada uniforme de dextran são essenciais.
Imagem prolongada de partículas do vírus podem lixívia as etiquetas fluorescentes ou levá-los a tornar-se desativado. Foto-dano deste tipo é bem conhecido na bio-imagem e campos única molécula e é acreditado geralme…
Acknowledgements
O trabalho foi suportado pelo NIH concede AI57159 (para SCH) e AI72346 (para AMvO). SCH é um Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
