Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe
Summary
Wir präsentieren einen<em> In vitro,</em> Zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay auf die Fusion einzelner Viruspartikel mit einer Flüssigkeit Ziel Doppelschicht zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung Viruspartikel mit Fluorophoren, die unterschiedlich Fleck der viralen Membran und im Inneren sind wir in der Lage, die Kinetik der hemifusion und Porenbildung zu überwachen.
Abstract
Membranfusion ist ein wesentlicher Schritt bei der Eingabe von umhüllten Viren in die Zellen. Konventionelle Fusion-Assays in der Regel über eine große Anzahl von Fusion Events, so dass es schwierig quantitativ zu analysieren die Reihenfolge der molekularen Schritte. Wir haben eine in vitro entwickelt, zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay zur Kinetik der einzelnen Viruspartikel Verschmelzung mit einer Ziel-Doppelschicht auf einer im Wesentlichen Flüssigkeit Unterstützung zu überwachen.
Influenza Virus-Partikel sind mit einem grünen lipophilen Fluorophor an die Membran und eine rote hydrophilen Fluorophor an die virale Innenraum Fleck Fleck inkubiert. Wir deponieren ein Gangliosid-haltigen Lipid-Doppelschicht auf der Dextran-funktionalisierten Glasoberfläche einer Durchflusszelle, bebrüten die Viruspartikel auf der planaren Bilayer und Bild der Fluoreszenz einer 100 x 100 pm 2-Gebiet, mit mehreren hundert Partikel, auf einem CCD Kamera. Durch die Abbildung die rote und grüne Fluoreszenz können wir gleichzeitig überwachen das Verhalten der Membran-Farbstoff (grün) und der wässrigen Inhalt (rot) der Partikel.
Beim Absenken des pH auf einen Wert unterhalb der Fusion pH-Wert, werden die Partikel mit der Membran verschmelzen. Hemifusion, die Verschmelzung der äußeren Blatt der viralen Membran mit dem äußeren Blatt der Zielmembran, wird sichtbar, wie eine plötzliche Veränderung in der grünen Fluoreszenz eines Teilchens. Bei der anschließenden Fusion der beiden verbleibenden distalen Flugblättern eine Pore wird gebildet werden und die rot-emittierenden Fluorophors in der Viruspartikel wird unter dem Zielmembran freigegeben werden. Diese Veranstaltung wird zu einer Abnahme der roten Fluoreszenz der einzelnen Teilchen. Schließlich berichtet der integrierten Fluoreszenz aus einer pH-sensitiven Fluorophor, dass in der Ziel-Membran eingebettet ist auf den genauen Zeitpunkt der pH-Abfall.
Von den drei Fluoreszenz-time Spuren lassen sich alle wichtigen Ereignisse (pH-Abfall-, Lipid-Mischung auf hemifusion, Content-Mischen nach Porenbildung) jetzt auf einfache Weise und für jedes Teilchen einzeln entnommen werden. Durch das Sammeln der verstrichenen Zeit für die verschiedenen Übergänge für viele einzelne Partikel in Histogramme, können wir die Lebensdauer der entsprechenden Zwischenprodukte. Auch versteckte Zwischenprodukte, die nicht über eine direkte Fluoreszenz beobachtbar können direkt visualisiert werden aus diesen Histogrammen.
Protocol
Discussion
Vorbereitung von Flüssigkeit und kontinuierliche Lipiddoppelschichten kann schwierig sein. Spuren von Verunreinigung materieller oder Oberflächenfehler verhindert Ausbreitung von Doppelschichten. Eine sorgfältige Reinigung und Abscheidung einer gleichmäßigen Schicht von Dextran sind unerlässlich.
Längerer Abbildung von Viruspartikeln können Bleichmittel der fluoreszierenden Markierungen oder diese wieder inaktiviert. Photo-Schäden dieser Art ist auch in der Bio-Imaging und Einzelmol…
Acknowledgements
Die Arbeit wurde durch die NIH gewährt AI57159 (SCH) und AI72346 (bis AMvO) unterstützt. SCH ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
