我们提出一种 体外 一种双色荧光检测方法，用于可视化单个病毒颗粒与流动靶向双层膜的融合过程。通过使用可差异标记病毒膜及其内部结构的荧光染料对病毒颗粒进行标记，我们能够监测半融合及融合孔形成的动力学过程。
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摘要
摘要
膜融合是包膜病毒进入细胞过程中的关键步骤。传统的融合检测方法通常报告大量融合事件，难以对其中涉及的分子步骤序列进行定量分析。我们已开发出一种 体外 一种双色荧光检测方法，用于监测单个病毒颗粒在近似流体支撑的双层膜上融合的动力学过程。
将流感病毒颗粒与一种绿色亲脂性荧光染料共同孵育以标记其膜结构，同时使用一种红色亲水性荧光染料标记病毒内部。我们在葡聚糖功能化的流动池玻璃表面沉积一层含有神经节苷脂的脂双层，将病毒颗粒孵育在平面脂双层上，并利用CCD相机对包含数百个病毒颗粒的100 × 100 μm2区域进行荧光成像。通过同时成像红色和绿色荧光，我们可以同步监测病毒膜染料（绿色）和病毒内部水相内容物（红色）的行为。
当pH降低至低于融合pH值时，颗粒将与膜发生融合。半融合，即病毒膜的外层小叶与靶膜的外层小叶合并，会表现为颗粒绿色荧光的突然变化。随后，两个剩余的远端小叶进一步融合，形成孔道，病毒颗粒内发射红色荧光的荧光染料将被释放至靶膜下方。该事件将导致单个颗粒红色荧光的减弱。最后，嵌入靶膜中的pH敏感型荧光染料所发出的整合荧光信号，可报告pH下降的确切时间。
从三条荧光-时间轨迹中，现在可以简便地逐个提取每个颗粒的所有重要事件（pH值下降、半融合时的脂质混合、孔形成时的内容物混合）。通过将大量单个颗粒各种转变所经历的时间收集到直方图中，我们可以确定相应中间态的寿命。即使是那些没有直接荧光信号可观测的隐含中间态，也可以直接从这些直方图中显现出来。
方案
盖玻片功能化
融合实验中使用的平面双层膜由一层水合葡聚糖薄膜支撑。葡聚糖在平面双层膜与玻璃表面之间起到间隔作用，防止膜组分粘附在玻璃表面，同时也为病毒颗粒融合后内容物的释放提供空间。通过环氧硅烷处理对玻璃盖玻片进行功能化修饰，可将葡聚糖化学键合至玻璃表面（Elender，et al. 1996）。
- 将25 mm盖玻片排列在陶瓷染色架中，并将该架放入广口瓶或烧杯内。
- 向容器中加入10%的实验室级玻璃器皿清洗剂溶液，将容器置于超声波清洗仪中清洗30分钟。
- 用去离子水冲洗容器及盖玻片架，然后重新注入1 M氢氧化钾溶液。再次将容器放入超声波清洗仪中处理30分钟。
- 依次使用丙酮和乙醇重复上述清洗步骤。
- 用清水冲洗盖玻片并干燥。
- 最后，使用氧气等离子体清洗仪对盖玻片处理3分钟。
- 该最终清洗步骤可使表面氧化，从而使玻璃在后续的硅烷化步骤中具有均匀的亲水性和反应活性。
- 配制0.2%的3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷异丙醇溶液，将盖玻片浸入该溶液中5分钟。
- 弃去硅烷溶液，并用异丙醇多次冲洗盖玻片。
- 此时盖玻片表面已形成一层硅烷涂层，但需进行固化处理，以使硅烷与玻璃表面形成共价键。将盖玻片置于80°C的烘箱中加热1小时。
- 在盖玻片固化的同时，称取葡聚糖500，配制30%（w/v）的....
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讨论
制备流体和连续支撑脂双层可能具有挑战性。微量的污染物或表面缺陷都会阻碍脂双层的铺展。仔细清洗并沉积一层均匀的葡聚糖至关重要。
长时间成像病毒颗粒可能导致荧光标记发生漂白或失活。此类光损伤在生物成像和单分子研究领域广为人知，通常认为是由激发态荧光分子产生活性氧物种所引起。为尽量减少光损伤，我们通常会降低激发激光功率，并避免在实验开始前进行长时间曝光。采用多种已报道的除氧系统之一将缓冲液中的氧气去除，可能有助于减轻这一问题。
要获取有关瞬态中间态的信息，必须精确同步融合反应。所使用的流速以及进样管路和流动池通道的死体积是可能限制同步性的因素。融合反应通过将中性pH缓冲液置换为酸性pH缓冲液来启动。然而，当酸性缓冲液流经进样管路进入流动池时，两种缓冲液之间的界面会因扩散而混合，并逐渐变得模糊不清。这会在双层膜表面形成pH梯度，导致起始时间的确定变得不清晰。此外，由于融合动力学依赖于质子浓度，实验开始时存在的pH梯度可能会使结果的解释复杂化。在本实验中，融合动力学过程远慢于pH转换时间，因此梯度效应对融合动力学的影响不显著。目前我.......
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为AI57159（授予S.C.H.）和AI72346（授予A.M.v.O.）。S.C.H. 是霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 康宁盖玻片，25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| 熔融石英载玻片 | Technical Glass | ||
| 染色架 | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3-环氧丙基)三甲氧基硅烷 | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| 葡聚糖 T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| 胆固醇 | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(生物素基)氨基)己酰基)-1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷脂–乙醇胺，三乙基铵盐 (生物素-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| 链霉亲和素-荧光素偶联物 | Invitrogen | S-869 | |
| 牛脑来源的双唾液酸神经节苷脂 GD1a | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| 微型挤出器 | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 微米聚碳酸酯膜滤器 | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm 排水盘（膜支撑物） | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| 磺基罗丹明B钠盐 | S1402 | ||
| 十八烷基罗丹明110 (Rh110C18) | 参见 Floyd et al. 2008 年发表的合成方案 | ||
| PD-10 脱盐柱 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 尼康荧光显微镜 | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA 物镜 | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr 激光器 | Coherent Inc. | ||
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 702213 |
参考文献
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
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重印与许可
