病毒融合动力学测量方法在单粒子能级
Summary
我们提出了一个<em在体外，</em>两色荧光分析法的可视化与流体的目标双层单个病毒粒子的融合。通过标记荧光基团的差异染色病毒的细胞膜和其内部的病毒颗粒，我们是能够监测hemifusion和孔隙形成的动力学。
Abstract
膜融合是包膜病毒进入细胞的过程中必不可少的步骤。通常传统的融合检测报告，大量的融合活动，使其难以定量分析的分子步骤的顺序。我们已经开发出体外，双色荧光检测，监视与目标上基本上是流体支持双层的单个病毒颗粒融合动力学。
流感病毒颗粒，是培养一个绿色的染色膜和一个红色的亲水性荧光团染色的病毒内部的亲脂性荧光团。我们一个神经节苷脂含脂双层存款右旋糖酐functionilized玻璃表面上的流通池，孵化平面双层和图像100 x 100微米2区的荧光的病毒颗粒，包含几百个粒子在防治荒漠化公约“，摄像头。成像，红色和绿色的荧光，我们可以同时监控膜染料（绿色）和水含量的颗粒（红色）的行为。
在降低pH值低于融合的pH值值，颗粒会与膜的融合。 Hemifusion，合并外病毒膜与目标膜外单张单张，将作为一种绿色荧光粒子的突然变化可见。后，随后剩下的两个远端单张融合，将形成一个孔，将目标膜下释放病毒颗粒的红色发光的荧光基团。此事件会引起减少单个粒子的红色荧光。最后，从pH敏感的荧光基团，是嵌入在目标膜集成荧光报告的pH值下降的确切时间。
从三个荧光痕迹，所有的重要事件（pH值下降，脂质混合后hemifusion，混合孔隙形成后的内容）现在可以在一个简单的方式和单独的每个粒子中提取。通过收集直方图许多单个粒子的各种转换的运行时间，我们可以判断相应的中间体的寿命。甚至隐藏中间体，没有一个直接的荧光观察，可以直接从显示这些直方图。
Protocol
Discussion
流体和连续支持的脂质双层的准备工作都具有挑战性。微量污染物质或表面缺陷会阻止双层扩散。仔细清洗和沉积一层均匀的葡聚糖是必不可少的。
长时间的病毒颗粒成像可以漂白的荧光标记，或使他们成为灭活。在生物成像和单分子领域的照片这种损害是众所周知的，一般认为源于激发荧光基团的产生活性氧。为了最大限度地减少照片损伤，我们一般尽量减少激发激光功?…
Acknowledgements
这项工作是支持由美国国立卫生研究院拨款AI57159（SCH）和AI72346（AMvO）。 SCH是霍华德休斯医学研究所的研究员。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
