Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella
Summary
Vi presentiamo uno<em> In vitro,</em> Bicolore saggio fluorescenza per visualizzare la fusione di particelle virali singolo con un doppio strato obiettivo fluido. Mediante l'etichettatura particelle virali con fluorofori che macchia in modo differenziato la membrana virale e il suo interno, siamo in grado di monitorare la cinetica di hemifusion e formazione di pori.
Abstract
Fusione della membrana è un passo essenziale durante l'immissione di virus con involucro in cellule. Saggi di fusione convenzionale tipicamente rapporto su un gran numero di eventi di fusione, il che rende difficile analizzare quantitativamente la sequenza delle fasi molecolari coinvolti. Abbiamo sviluppato un in vitro, a due colori saggio a fluorescenza per monitorare la cinetica di fusione singole particelle virali con un doppio strato obiettivo su un supporto essenzialmente fluido.
L'influenza delle particelle virali sono incubati con un fluoroforo verde lipofile di macchiare la membrana e un fluoroforo rosso idrofilo per colorare l'interno virale. Abbiamo un deposito gangliosidi contenenti doppio strato lipidico sul destrano-functionilized superficie di vetro di una cella a flusso, incubare le particelle virali nel doppio strato planare e l'immagine della fluorescenza di un x 100 100 micron 2 Superficie, contenente diverse centinaia di particelle, su un CCD fotocamera. Per immagini sia la fluorescenza rossa e verde, siamo in grado di monitorare contemporaneamente il comportamento del colorante membrana (verde) e il contenuto acquoso (rosso) delle particelle.
Su abbassando il pH ad un valore al di sotto del pH fusione, le particelle si fondono con la membrana. Hemifusion, la fusione dei foglietto esterno della membrana virale con il foglietto esterno della membrana bersaglio, sarà visibile come un cambiamento improvviso della fluorescenza verde di una particella. Al momento della fusione dei due successivi volantini rimasti distale un poro sarà formata e il rosso che emettono fluoroforo nella particella virale sarà rilasciato sotto la membrana di destinazione. Questo evento darà luogo ad una diminuzione della fluorescenza rossa delle singole particelle. Infine, la fluorescenza integrato da un pH-sensibile fluoroforo che è incorporato nella membrana di destinazione indica il momento esatto della caduta di pH.
Dai tre fluorescenza in tempo le tracce, tutti gli eventi importanti (calo del pH, lipidi miscelazione su hemifusion, i contenuti di miscelazione sulla formazione dei pori) possono ora essere estratte in modo diretto e per ogni particella singolarmente. Raccogliendo i tempi trascorsi per le transizioni diverse per molte singole particelle in istogrammi, possiamo determinare la durata degli intermedi corrispondenti. Anche intermedi nascosti che non hanno un diretto osservabile fluorescenti possono essere visualizzati direttamente da questi istogrammi.
Protocol
Discussion
Preparazione di liquido e continuo doppi strati lipidici supportati può essere impegnativo. Tracce di contaminanti difetti di materiale o superficie impediscono la diffusione di doppi strati. Pulizia accurata e la deposizione di uno strato uniforme di destrano sono essenziali.
L'imaging prolungata di particelle di virus può candeggina le etichette fluorescenti o farli diventare inattivato. Foto-danni di questo tipo è ben noto nella bio-imaging e campi di singola molecola ed è general…
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da NIH concede AI57159 (a SCH) e AI72346 (a AMvO). SCH è un Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
