Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level
Summary
We presenteren een<em> In vitro,</em> Twee-kleuren fluorescentie assay om de fusie van enkele virusdeeltjes te visualiseren met een vloeistof doel bilaag. Door middel van etikettering virale deeltjes met fluoroforen dat differentieel vlekken op de virale membraan en het interieur, we zijn in staat om de kinetiek van hemifusion en poriën vorming van monitoren.
Abstract
Membraanfusie is een essentiële stap tijdens het invoeren van envelop-virussen in cellen. Conventionele fusie assays meestal over een groot aantal van fusie gebeurtenissen, waardoor het moeilijk kwantitatief te analyseren van de volgorde van de betrokken moleculaire stappen. Hebben we een in vitro, twee-kleuren fluorescentie assay om kinetiek van enkele virusdeeltjes fusing-monitor met een doel bilaag in hoofdzaak op vloeistof te ondersteunen.
Influenza virusdeeltjes worden geïncubeerd met een groene lipofiel fluorofoor aan het membraan en een rode hydrofiele fluorofoor aan de virale interieur vlek vlek. We hebben een ganglioside-bevattende lipide bilaag afzetting op de dextran-functionilized glazen oppervlak van een flow cel, incubeer de virale deeltjes op de vlakke bilaag en het imago van de fluorescentie van een 100 x 100 micrometer 2-gebied, met daarin enkele honderden deeltjes, op een CCD camera. Door beeldvorming zowel de rode en groene fluorescentie, kunnen we tegelijkertijd toezien op het gedrag van het membraan kleurstof (groen) en de waterige inhoud (rood) van de deeltjes.
Bij het verlagen van de pH op een waarde onder de fusie pH-waarde, zullen de deeltjes fuseren met het membraan. Hemifusion, de samenvoeging van de buitenste folder van de virale membraan met de buitenste folder van het doelwit membraan, wordt zichtbaar als een plotselinge verandering in de groene fluorescentie van een deeltje. Bij de daarop volgende fusie van de twee overgebleven distale folders een porie zal worden gevormd en de rode-emitterende fluorofoor in het virale deeltje zal worden vrijgegeven onder de doelgroep membraan. Dit evenement zal aanleiding geven tot een daling van de rode fluorescentie van individuele deeltjes. Ten slotte is de geïntegreerde fluorescentie van een pH-gevoelige fluorofoor dat is ingebed in het doel membraan rapporten over de exacte tijd van de pH-daling.
Van de drie fluorescentie-tijd sporen, kunnen alle belangrijke gebeurtenissen (pH-daling, lipide mengen op hemifusion, content mixen op poriën vorming) nu worden gewonnen op een eenvoudige wijze en voor elk deeltje afzonderlijk. Door het verzamelen van de verstreken tijd voor de verschillende overgangen voor veel individuele deeltjes in histogrammen, kunnen we de levens van de bijbehorende tussenproducten. Zelfs verborgen tussenproducten die niet beschikken over een directe fluorescerende waarneembare kunnen direct worden gevisualiseerd uit deze histogrammen.
Protocol
Discussion
De voorbereiding van vocht en continue ondersteund lipidendubbellagen kan een uitdaging zijn. Sporen van verontreinigende materiaal of oppervlak fouten zal voorkomen dat de verspreiding van dubbellagen. Zorgvuldige reiniging en afzetting van een uniforme laag van dextran zijn essentieel.
Langdurig beeldvorming van virusdeeltjes kan het bleken van de fluorescente labels of ervoor zorgen dat ze worden geïnactiveerd. Foto-schade van deze soort is bekend in de bio-imaging en single molecule vel…
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door NIH subsidie AI57159 (tot SCH) en AI72346 (tot AMvO). SCH is een Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
