単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法
Summary
我々は存在する<em> in vitroで、</em> 2つの色の液体ターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融合を可視化する蛍光アッセイ。差ウイルス膜とその内部を染色する蛍光団でウイルス粒子を標識することにより、我々はhemifusionと細孔形成の動態を監視することができます。
Abstract
膜融合は、細胞内へのエンベロープウイルスの入力時に必須の工程である。従来の核融合アッセイは、通常、それは難しい関係する分子の手順のシーケンスを定量的に分析すること、核融合の多数のイベントを報告する。我々は本質的に流体のサポート上のターゲットの二重層を持つ単一のウイルス粒子の融着の速度を監視するためin vitroで、2色の蛍光アッセイを開発した。
インフルエンザウイルス粒子が細胞膜とウイルスの内部を染色する赤親水性の蛍光物質を染色する緑色の脂溶性蛍光体とインキュベートされています。我々は、フローセルのデキストラン- functionilizedガラスの表面にガングリオシドを含む脂質二重膜を堆積、CCD上の粒子の数百を含む、平面二重層と画像100 × 100μmの2領域の蛍光でウイルス粒子をインキュベートカメラ。イメージングの両方赤と緑の蛍光によって、我々は、同時に膜の色素（緑）と粒子の水性内容（赤）の動作を監視することができます。
融合のpH下の値にpHを下げる際に、粒子は、膜と融合するだろう。 Hemifusionは、標的膜の外葉とウイルス膜の外葉の融合、粒子の緑色蛍光の急激な変化として表示されます。残り2つの遠位リーフレットのその後の融合時に細孔が形成され、ウイルス粒子の赤色発光蛍光体は、標的膜の下にリリースされる予定です。このイベントは、個々の粒子の赤色蛍光の減少を生じさせるだろう。最後に、標的膜に埋め込まれているpH感受性蛍光体からの統合された蛍光はpHの低下の正確な時間を報告します。
three蛍光時のトレースから、すべての重要なイベント（pHの低下、孔形成時に混合hemifusion、コンテンツに応じて混合脂質）は、現在直接的な方法で、個々にすべての粒子について、抽出することができます。ヒストグラムの多くの個々の粒子のための様々な遷移のために経過時間を収集することにより、我々は、対応する中間体の寿命を決定することができます。直接蛍光観察を持っていなくても隠された中間体は、これらのヒストグラムから直接可視化することができます。
Protocol
Discussion
流体と連続的なサポートされている脂質二分子膜の調製が困難な場合があります。材料や表面欠陥を汚染の微量の脂質二重層の拡散防止します。デキストランの均一な層を慎重に洗浄し、堆積が不可欠です。
ウイルス粒子の長時間のイメージングは、漂白剤蛍光ラベルをまたはそれらを不活化になることがあります。この種の光損傷はよくバイオイメージングおよ?…
Acknowledgements
作品は、NIHの助成金AI57159（SCH）およびAI72346（AMvOまで）によってサポートされていました。 SCHは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者です。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
