のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行
Summary
ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。
Abstract
使用して多くの研究のアドレスの細胞遊走<em> in vitroで</em>の方法は、生理学的に関連する環境に対し、生物自体のことです。ここでは、取り付けのためのプロトコルを提示<em>キイロショウジョウバエ</em>胚と蛍光標識血球のその後のライブイメージング、この生物の胚マクロファージ。 GAL4 – UASシステムを使用する<sup> 1</sup>我々は胚全体に彼らの発達分散に従うことを血球に遺伝的に符号化された、蛍光標識マーカーの様々な発現を駆動する。開発の目的の段階で胚のコレクションに続いて、外側の絨毛膜が除去され、胚は、その後疎水性、ガス透過膜とライブイメージング用ガラスカバースリップ間のハロカーボンのオイルにマウントされます。このような速度と方向性として総渡り鳥のパラメータに加えて、蛍光F -アクチンの記者と微小管の使用と相まって、高解像度のイメージングは、これらの細胞骨格成分の動態に関するより詳細な情報を提供することができます。
Protocol
準備血球特異Gal4のドライバ（例：SRP – Gal4の 2）とUAS制御（例えば、UAS – GFP）の下で遺伝的に符号化された蛍光レポーターを含む適切なショウジョウバエの行を取得します。 SRP – GAL4、UAS – GMA 3またはCRQ – GAL4、UAS – GFP 4、5のホモ接合体ハエは、イメージングのために（NB GMAはモエシンのアクチン結合ドメインに融合したGFPです）…
Discussion
この手順の最も重要な要素は明記された血球との健全な胚の選択であり、それらを傷つけることなく慎重にそれらをマウントする。一度胚は、脱水に耐性があると一度にマウントされている数時間のためにイメージングすることができるハロカーボンのオイルになります。私たちの手では40倍の目標と私たちのツァイスLSM510共焦点顕微鏡で3分ごとに画像のz -スタックを取っ胚やフォトダメー?…
Acknowledgements
このプロトコルは、ポールマーティンとアントニオサンジャシントの研究室とのコラボレーションの中でとの我々の仕事を通じて開発されています。我々は、フライラインを共有し続けるための素晴らしいサービスとショウジョウバエコミュニティのためのブルーミントンストックセンターに感謝します。 BSは現在BBSRCプロジェクトの助成金によって賄われています。 WWは、ウェルカムトラストのキャリア開発奨学金によって運営されている。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | 70μm pores | |
| Halcarbon oil 700 | Sigma | H8898 | ||
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt | 96077305 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruckner, K. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, 73-84 (2004).
- Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34, 146-151 (2002).
- Stramer, B. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Halfon, M. S. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34, 135-138 (2002).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila protocols. , (2000).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, 1829-1837 (1994).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, 621-626 (2008).
- Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130, 3965-3975 (2003).
- Olofsson, B., Page, D. T. Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity. Dev Biol. 279, 233-243 (2005).
- Paladi, M., Tepass, U. Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila. J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).
- Vlisidou, I. Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time. PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).
- Jacinto, A. Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure. Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).
- Wood, W., Jacinto, A. Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos. Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).
- Kunwar, P. S. Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin. J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).
Tags
Live ImagingDrosophila MelanogasterEmbryonic Hemocyte MigrationsIn Vitro MethodsPhysiologically Relevant EnvironmentMounting ProtocolFluorescently Labeled HemocytesGal4-uas SystemGenetically Encoded MarkersDevelopmental DispersalEmbryo CollectionOuter Chorion RemovalHalocarbon OilHydrophobic MembraneGlass CoverslipGross Migratory ParametersSpeedDirectionalityHigher Resolution ImagingF-actinMicrotubulesCytoskeletal Components
Cite This Article
Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696, doi:10.3791/1696 (2010).