Drosophila hemocyter sprida över hela det växande embryot. Detta protokoll visar hur du monterar och bild dessa vandringar med hjälp av embryon med fluorescerande hemocyter.
Många studier adress cell migration med<em> In vitro</em> Metoder, medan den fysiologiskt relevanta miljön är att av organismen själv. Här presenterar vi ett protokoll för montering av<em> Drosophila melanogaster</em> Embryon och efterföljande leva avbildning av fluorescerande hemocyter, den embryonala makrofager av denna organism. Använda Gal4-UAS-system<sup> 1</sup> Kör vi ett uttryck för en variation av genetiskt kodade, fluorescerande taggade markörer i hemocyter att följa deras utveckling spridning i hela embryot. Efter insamlingen av embryon på önskad utvecklingsstadium, är det yttre chorion bort och embryona sedan monteras i Halocarbon olja mellan en hydrofoba, gas-membran och ett glas täckglas för live avbildning. Förutom grov vandrande parametrar som hastighet och riktning, högre upplösning bildbehandling i kombination med användning av fluorescerande reportrar för F-aktin och mikrotubuli kan ge mer detaljerad information om dynamiken i dessa cytoskelettala komponenter.
De viktigaste delarna i detta förfarande är urvalet av friska embryon med tydligt märkta hemocyter och att montera dem försiktigt utan att skada dem. När embryon i Halocarbon olja de är resistenta mot uttorkning och en gång monterade kan avbildas i flera timmar. I våra händer kan vi bilden hemocyter i tre timmar, med försumbar uttorkning av embryo eller tydliga foto-skador, med ett z-stack av bilder var tredje minut på vår Zeiss LSM510 konfokalmikroskop med 40X objektiv. Eftersom hemocyter mycket dynamiska d…
Detta protokoll har utvecklats genom vårt arbete inom och i samarbete med laboratorier av Paul Martin och Antonio Jacinto. Vi tackar Bloomington Stock centrum för sin utmärkta service och den Drosophila community för att fortsätta dela flyga linjer. BS är för närvarande finansieras genom en BBSRC projektbidrag. WW är finansierad av ett Wellcome Trust Career Development Fellowship.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | 70μm pores | |
Halcarbon oil 700 | Sigma | H8898 | ||
Lumox/Petriperm dish | Sarstedt | 96077305 |