Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression
Summary
Dieser Artikel veranschaulicht die floral-dip-Methode der<em> Agrobacterium tumefaciens</em>-Vermittelte Transformation von<em> Arabidopsis thaliana</em>. Durch die Einführung eines Zellzyklus-regulierten Promotor-Reporter<em> PTSO2: β-Glucuronidase (GUS)</em>, In<em> Arabidopsis</em>, Zeigt uns, wie man GUS-Reporter Expression in transgenen Keimlinge erkennt.
Abstract
Die Fähigkeit, fremde Gene in einen Organismus einbringen ist das Fundament für die moderne Biologie und Biotechnologie. In das Modell blühende Pflanze<em> Arabidopsis thaliana</em>, Die floral-dip Transformationsmethode<sup> 1-2</sup> Hat alle bisherigen Methoden wegen seiner Einfachheit, Effizienz und geringen Kosten ersetzt. Genauer gesagt, schießt der junge Blüte<em> Arabidopsis</em> Pflanzen werden in einer Lösung aus getaucht<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Durchführung spezifischer Plasmid-Konstrukte. Nach dem Eintauchen werden die Pflanzen auf ein normales Wachstum und besserem Saatgut, ein kleiner Prozentsatz der die mit dem fremden Gen transformiert und können bei Medium mit Antibiotika ausgewählt werden zurückgegeben. Das blumig-dip-Methode wesentlich erleichtert<em> Arabidopsis</em> Forschung und trug wesentlich zu unserem Verständnis der pflanzlichen Gen-Funktion. In dieser Studie verwenden wir die floral-Tauchverfahren mit einem Reportergen zu verwandeln,<em> Β-Glucuronidase (GUS)</em>, Unter der Kontrolle von<em> TSO2</em> Promotor.<em> TSO2</em>, Kodierend für die Ribonucleotid-Reductase (RNR) kleine Untereinheit<sup> 3</sup>, Ist ein Zellzyklus reguliert essentielles Gen für die Biosynthese dNDP in der S-Phase des Zellzyklus. Untersuchung der<em> GUS</em> Expression in transgenen<em> Arabidopsis</em> Keimlinge zeigt, dass<em> TSO2</em> Ist in sich aktiv teilenden Geweben exprimiert. Die berichteten experimentellen Methode und Materialien können problemlos nicht nur für die Forschung, sondern auch für die Bildung werden an der High School und College-Niveau angepasst.
Protocol
Discussion
Die Effizienz der Transformation wird durch viele verschiedene Faktoren, die im Folgenden diskutiert bestimmt:
- Die Gesundheit der Pflanzen und deren Alter von primärer Bedeutung sind. Etwa einen Monat alten Anlagen zur Produktion von zahlreichen unreifen Blütenknospen sind ideal. Trimmen Sie primäre Triebe zu fördern sekundären Sproßbildung 3-4 Tage vor der Transformation erhöht Transformationseffizienz. Ältere Pflanzen werden steigen, um Transformanten zu geben, sondern zu einem niedrigeren Zinssat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Chunxin Wang für den Bau pTSO2:: GUS und für Fotos in Abbildung 1, Detlef Weigel für die gemeinsame Nutzung der GUS-narrensicher Protokoll, Paja Sijacic und Courtney Hollender für hilfreiche Kommentare. Research in Z. L s Labor ist von der US National Science Foundation (IOB0616096 und MCB0744752) unterstützt. ZL wird teilweise durch die University of Maryland Agricultural Experiment Station unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 6-benzyladenine | Sigma | 852430 | ||
| Silwet-77 | Crompton Corp. | Toxic, wear gloves | ||
| Murashige and Skoog Basal medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| Gamborg’s vitamin solution 1000X | Sigma | G1019 | ||
| X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt | Biosynth | B-7300 | Toxic, light sensitive keep in the dark | |
| Micropore 3M Tape | Fisher | 19027761 |
References
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
