Blom-dip Omvandling av Arabidopsis thaliana För att undersöka PTSO2:: β-glukuronidasaktivitet Reporter Gene Expression
Summary
Den här artikeln illustrerar den blommiga-dip metoden<em> Agrobacterium tumefaciens</em>-Medierad omvandling av<em> Arabidopsis thaliana</em>. Genom att införa en cell-cykel reglerade promotor-reporter,<em> PTSO2:: β-glukuronidas (GUS)</em>, Till<em> Arabidopsis</em>, Visar vi hur en upptäcker GUS reporter uttryck i transgena plantor.
Abstract
Den förmåga att introducera främmande gener i en organism är grunden för modern biologi och bioteknik. I modellen blommande växt<em> Arabidopsis thaliana</em>, Den blommiga-dip omvandling metod<sup> 1-2</sup> Har ersatt alla tidigare metoder grund av dess enkelhet, effektivitet och låg kostnad. Specifikt skott av unga blommande<em> Arabidopsis</em> Växter doppas i en lösning av<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Bär specifika plasmid konstruktioner. Efter doppa, är de växter som återgått till normal tillväxt och frön avkastning, en liten del av som omvandlas med främmande gen och kan väljas för på ett medium som innehåller antibiotika. Denna blommiga-dip-metoden avsevärt underlättas<em> Arabidopsis</em> Forskning och hög grad bidragit till vår förståelse av växt geners funktion. I denna studie använder vi blommor-dip metoden att omvandla en reporter gen,<em> Β-glukuronidas (GUS)</em>, Under kontroll av<em> TSO2</em> Promotor.<em> TSO2</em>, Som kodar för ribonukleotidreduktas (RNR) liten subenhet<sup> 3</sup> Är en cellcykeln regleras gen viktigt för dNDP biosyntesen i S-fasen av cellcykeln. Granskning av<em> GUS</em> Uttryck i transgena<em> Arabidopsis</em> Plantor visar att<em> TSO2</em> Uttrycks i aktivt delande vävnad. Det redovisade experimentella metod och material kan enkelt anpassas inte bara för forskningen utan också för utbildning på gymnasiet och nivåer college.
Protocol
Discussion
Effektiviteten i omvandlingen bestäms av många olika faktorer, som diskuteras nedan:
- Hälsan hos växter och deras ålder är av största vikt. Ungefär en månad gamla anläggningar som producerar många omogna blommiga knoppar är idealiska. Trimning av primära skott för att stimulera sekundära skjuta bildandet 3-4 dagar innan förvandlingen kommer att öka omvandlingseffektiviteten. Äldre anläggningar kommer att ge upphov till transformants men i lägre takt.
- Fertilitet av anläggningarn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Chunxin Wang för att bygga pTSO2:: GUS och för foton i figur 1, Detlef Weigel för att dela GUS-idiotsäkert protokoll, Paja Sijacic och Courtney Hollender för hjälpsamma kommentarer. Forskning i Z. L laboratorium stöds av US National Science Foundation (IOB0616096 och MCB0744752). ZL är delvis stöds av University of Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 6-benzyladenine | Sigma | 852430 | ||
| Silwet-77 | Crompton Corp. | Toxic, wear gloves | ||
| Murashige and Skoog Basal medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| Gamborg’s vitamin solution 1000X | Sigma | G1019 | ||
| X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt | Biosynth | B-7300 | Toxic, light sensitive keep in the dark | |
| Micropore 3M Tape | Fisher | 19027761 |
References
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
