El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei
Summary
Los telómeros son esenciales para la estabilidad de los cromosomas y los telómeros G-voladizo estructura es esencial para la telomerasa mediada mantenimiento de los telómeros. Recientemente hemos aprobado dos métodos para la detección de los telómeros G-estructura en voladizo<em> Trypanosoma brucei</em>, Que son nativos en gel de hibridación y la ligadura mediada por extensión del cebador, que se describe.
Abstract
Los telómeros G-voladizo estructura ha sido identificada en muchos eucariotas como levaduras, los vertebrados, y Trypanosoma brucei. Que sirve como sustrato para la telomerasa para la síntesis de novo del ADN de los telómeros y por lo tanto, es importante para el mantenimiento de los telómeros. T. brucei es un parásito protozoario que causa la enfermedad del sueño en los seres humanos y nagana en el ganado. De acogida, una vez infectados los mamíferos, T. celular brucei regularmente cambia su antígeno de superficie para evadir el ataque inmunológico del huésped. Recientemente hemos demostrado que el T. brucei estructura de los telómeros desempeñan un papel esencial en la regulación de la expresión del gen del antígeno de superficie, lo cual es fundamental para la T. brucei patogénesis. Sin embargo, T. brucei estructura de los telómeros no ha sido ampliamente estudiado debido a la limitación de los métodos para el análisis de esta estructura especializada. Ahora hemos adoptado con éxito los nativos en gel de la hibridación y la ligadura mediada por los métodos de extensión del cebador para el examen de los telómeros G-voladizo estructura y un método de ligadura de adaptador para la determinación de la terminal de los telómeros de nucleótidos en T. brucei células. Aquí, vamos a describir en detalle los protocolos y comparar sus ventajas y limitaciones.
Protocol
Discussion
Tripanosoma brucei causa la enfermedad del sueño en los seres humanos. Esta enfermedad, si no se trata, es inevitablemente fatal. T. células brucei en huéspedes mamíferos sufren variación antigénica con regularidad con el fin de evadir el ataque inmune del huésped 7. Por lo tanto, es muy difícil de eliminar T. brucei células una vez que la infección se ha establecido. Recientemente hemos demostrado que los telómeros desempeñan un papel importante en la regulaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la Dra. Carolyn Precio de los debates científicos y sugerencias perspicaces. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención AI066095 (PI: Bibo Li).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | ||
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma | A4018 | ||
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Diagnostic | 03 115801001 | ||
| Exo I | NEB | M0293 | ||
| Exo T | NEB | M0265 | ||
| T7 exonuclease | NEB | M0263 | ||
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203 | ||
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
References
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
