Summary
התכנון הניסיוני המוצג כאן מספק מודל רבייה שימושי למחקרים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות בלוטות הלימפה (LN), אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T עוברי אורח.
Abstract
תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול מבלוטות לימפה מתנקזות מקבלים חשיבות מצטברת בהגברת התגובה החיסונית נגד הגידול במהלך הגידול. עם זאת, במקרים רבים, תאים סרטניים יוצרים מוקדים גרורתיים בבלוטות הלימפה לפני גרורות נוספות לאיברים מרוחקים. באיזו מידה התגובות המקומיות והשיטתיות של תאי CD8+ T הושפעו מגרורות LN נותרה מעורפלת. לשם כך, הקמנו מודל גרורות LN מורין בשילוב עם קו תאי מלנומה B16F10-GP המבטא את הניאואנטיגן החלופי הנגזר מנגיף כוריאומנינגיטיס לימפוציטית (LCMV), גליקופרוטאין (GP) ועכברים טרנסגניים P14 בעלי קולטני תאי T (TCRs) ספציפיים לפפטיד GP33-41 שמקורו ב-GP המוצג על ידי מולקולת קומפלקס היסטותאימות גדולה (MHC) מסוג I H-2Db. פרוטוקול זה מאפשר לחקור תגובות ספציפיות לתאי CD8+ T של אנטיגן במהלך גרורות LN. בפרוטוקול זה, עכברי C57BL/6J הושתלו תת עורית עם תאי B16F10-GP, ולאחר מכן העברה מאומצת עם תאי P14 נאיביים. כאשר הגידול התת עורי גדל לקוטר של כ-5 מ"מ, הגידול הראשוני נכרת, ותאי B16F10-GP הוזרקו ישירות לבלוטת הלימפה המנקזת את הגידול (TdLN). לאחר מכן, הדינמיקה של תאי CD8+ T נוטרה במהלך תהליך גרורות LN. באופן קולקטיבי, מודל זה סיפק גישה לחקור במדויק את התגובה החיסונית הספציפית לאנטיגן CD8+ T של תאי T במהלך גרורות LN.
Introduction
אימונותרפיה לסרטן, במיוחד חסימת נקודות בקרה חיסוניות (ICB), חוללה מהפכה בטיפול בסרטן1. ICB חוסם את קולטני החיסון המעכבים (כגון PD-1, Tim-3, LAG-3 ו- TIGIT), אשר באים לידי ביטוי גבוה בתאי CD8+ T מותשים במיקרו-סביבה של הגידול (TME), מה שמוביל להתחדשות של תאי CD8+ T מותשים2. בהתחשב בהטרוגניות של תאי CD8+ T מותשים, עדויות מצטברות גילו כי תאי CD8+ T ספציפיים לגידול שמקורם בפריפריה, כולל ניקוז בלוטת הלימפה (dLN), אך לא ב- TME, מתווכים את היעילות של ICB 3,4,5,6,7,8. לאחרונה, TdLN נגזר TCF-1+TOX- זיכרון ספציפי לגידול CD8+ תאי T (TdLN-TTSM) אושר להיות המגיבים המקוריים ICB אשר מגלמים מספר תכונות פונקציונליות של תאי זיכרון T קונבנציונאלי יכול להרחיב עוד יותר להתמיין לתאים מותשים צאצאים עם טיפול ICB9. בסך הכל, ממצאים אלה איששו את החשיבות של LN בהגברת חסינות נגד גידולים.
בלוטת הלימפה מתפקדת כמקום קריטי בהקלת ההכנה וההפעלה של תאי CD8+ T ספציפיים לגידול על ידי מתן בסיס מבני כמו גם אותות ביולוגיים10. מספר סוגים של תאים סרטניים זורעים לעתים קרובות בלוטת לימפה של זקיף (SLN, ה- LN הראשון המנקז גידול ראשוני) לפני הפצה שיטתית11. נוכחות גרורות SLN קשורה לתוצאות גרועות בסרטן אנושי ומודלים פרה-קליניים הראו כי תאי גידול ב- TdLN יכולים להתפשט לאיברים מרוחקים דרך כלי הלימפה וכלי הדם של הצומת 12,13,14,15. ביופסיית SLN מייצגת כעת הליך סטנדרטי המנחה החלטות טיפול עוקבות בסוגי גידולים מוצקים רבים שיכולים למנוע כריתה מיותרת של LN 16,17 בלתי מעורב. אפילו לגבי LN המעורב, זה עדיין שנוי במחלוקת אם ומתי יש צורך בכריתה כירורגית מכיוון שמספר מחקרים הוכיחו כי הסרת LN אזורי לא הציגה הישרדות כוללת משופרת בהשוואה לאלה שקיבלו קרינה או טיפול סיסטמי ללא כריתת LN אזורית 18,19. פרשנות אחת היא כי LN גרורתי (mLN) עם מחלה מיקרוסקופית עשוי לשמור על יכולת מסוימת לחנך תאים חיסוניים ולספק כמה יתרונות טיפוליים. לכן, חשוב ביותר להבהיר כיצד גרורות LN משפיעות על התגובה החיסונית נגד הגידול, במיוחד על התכונות והתפקודים של TdLN-TTSM.
עד כה, נתונים פרה-קליניים וקליניים כאחד חשפו כמה שינויים מבניים ותאיים ב-mLN20. עם זאת, השינויים הדינמיים של תאי CD8+ T ספציפיים לגידול במהלך גרורות LN לא תוארו. לכן, פיתוח מודל משכנע של גרורות LN נדרש לחקירה נוספת. ואכן, מספר מחקרים דיווחו על מודלים של עכברי mLN בדרכים שונות 14,21,22. לדוגמה, גרורות ספונטניות ב- LN בבית השחי בוצעו באמצעות השתלת תאי סרטן שד 4T1 לתוך כרית שומן החלב22. במחקר אחר, Reticker-Flynn et al. יצרו שורות תאי מלנומה עם שכיחות גבוהה של התפשטות מגידול ראשוני תת-עורי ל- LNs באמצעות חיסון סדרתי של תאי גידול בתרבית מרקמות mLN מנותקות (תשעה סבבים)14. מודל נפוץ נוסף הוכן על ידי הזרקת תאי גידול לתוך כרית כף הרגל והמוקדים הגרורתיים ייווצרו בפופליטל LN22. יש לציין כי קשה להעריך את נקודות הזמן המדויקות של ההתערבות מכיוון שגרורות LN במודלים אלה אינן תמיד נאמנות.
במחקר הנוכחי, מודל גרורתי LN מורין הוקם באמצעות הזרקה intranodal של B16F10-GP תאים23,24, שנוצר על ידי החדרה בתיווך CRISPR / Cas9 של רצף הגן גליקופרוטאין וירוס LCMV (GP) לתוך הגנום של B16F10 קותא 9. לאחר מכן, עכברים אלה הועברו עם תאי P14 אשר מכילים קולטני תאי T טרנסגניים (TCRs) לזהות באופן ספציפי את H-2Db GP33-41 אפיטופ25,26 ואת הדינמיקה המערכתית והמקומית של תאי CD8+ T ספציפיים אנטיגן במהלך גרורות LN ניתן לחקור. תכנון הניסוי שלנו מספק מודל שימושי לחקר תגובות חיסוניות, במיוחד תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות LN אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T של צופה מהצד. תוצאות אלה ישפיעו על אפשרויות הטיפול הקליני האם להסיר או לשמור את ה- mLN וישפכו אור חדש על המניפולציה של mLN כדי להשיג יתרונות טיפוליים מקסימליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברי C57BL/6J (המכונים עכברי B6) ועכברי P14 טרנסגניים נאיביים 9,27 היו בני 6-10 שבועות במשקל 18-22 גרם. הן זכר והן נקבה נכללו ללא אקראיות או סינוור. כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של צ'ינגדאו.
1. הכנת מדיום וריאגנטים
- הכינו מדיום תרבית תאי מלנומה B16F10-GP, בשם D10 (מדיום DMEM מלא) על ידי הוספת DMEM, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין עם 100 U/mL נוספים בפורומיצין. יש לשמור על D10 סטרילי ולאחסן עד שבועיים בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס.
- הכינו מדיום R2 (להפסקת ליזה של תאי דם אדומים) על ידי הוספת RPMI-1640 עם 2% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין.
- הכינו מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) על ידי הוספת 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 2% FBS ו-0.01% נתרן אזיד. תוספת של נתרן אזיד יכול להאריך את זמן האחסון של מאגר FACS, אשר ניתן לאחסן במשך חודשים ב 2-4 ° C.
- הכינו את מאגר הליזה של תאי הדם האדומים (RBL) על ידי הוספת 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 ו-0.1 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) למים מזוקקים כפול והתאימו את רמת החומציות שלהם ל-7.3. אחסנו את מאגר RBL בטמפרטורת החדר (RT) והוא יישאר יציב למשך עד 3 חודשים.
- הכינו את חומר ההרדמה, 2,2,2-tribromoethanol, כמתואר להלן.
- שקול כמות מתאימה של גביש 2,2,2-tribromoethanol בצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל עטוף ברדיד אלומיניום. הוסף כמות מתאימה של 2-מתיל-2-בוטנול לגביש כדי להכין את תמיסת הציר בריכוז של 500 מ"ג/מ"ל.
- מערבלים אותו כדי לערבב ולחמם את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להמסת הגביש. ודא שכל הגבישים מומסים.
- ערבבו היטב את התמיסה ביסודיות. סנן את תמיסת המלאי עם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך מיכל סטרילי. אחסן את תמיסת המלאי קפואה, מוגנת מפני אור, ב -20 ° C או לדלל עם PBS לתוך פתרון עבודה בריכוז של 12.5 מ"ג / מ"ל ומאוחסן ב 4 ° C.
הערה: עדיף להשתמש בריכוז שנקבע מכיוון שריכוזים גבוהים יותר של הנוזל מרגיזים.
2. הכנת תרחיף תאי B16F10-GP
- הפשרה ותרבית בקבוקון של 1 x 106 תאי B16F10-GP עם 5 מ"ל של D10 באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C ו 5% CO2. תאי תת-תרבית כאשר הם הגיעו לצפיפות של 80% עד 90% כמתואר להלן.
- השליכו את מדיום התרבית המקורי על ידי שאיפה עם אקדח פיפטינג ושטפו את התאים 2x עם PBS. בעת ניקוי תאים דבקים עם PBS בצלחת תרבית תאים, להזיז את PBS לדופן הצדדית או לזרוק אותו לתוך הצלחת.
- לאחר שאיפה של PBS, להוסיף 0.5-1 מ"ל של 0.25% תמיסת טריפסין EDTA לצלחת תרבית התא או צלוחיות. נערו בעדינות כדי לכסות את כל שטח התא. הניחו את צלחת תרבית התאים או הבקבוק באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך כדקה או ב-RT עד שהתאים מעוגלים ומופרדים. צפו פילינג של תאים בעזרת מיקרוסקופ הפוך.
- הוסף נפח שווה של D10 טרי כדי לסיים את עיכול טריפסין. לטהר את פני השטח התחתונים של בקבוק תרבית התא עם אקדח פיפטינג כדי להבטיח שכל התאים מופרדים.
- העבר את מתלה התאים B16F10-GP לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 163 x גרם למשך 4 דקות ב- RT.
- לשאוף את הסופרנאטנט ולהשליך. להשעות את התאים ב 1-2 מ"ל של D10 עבור משקעים. העבירו את תרחיף תאי B16F10-GP לצלחת או בקבוק תרבית תאים חדשים המכילים 8-10 מ"ל של D10 ולאחר מכן דגרו באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO2.
- ביום השתלת הגידול, לאסוף תאי B16F10-GP עם צפיפות של כ 90% כמתואר בשלבים 2.1.1 עד 2.1.4. לאחר הצנטריפוגה, שואפים את הסופרנאטנט ומשליכים. להשעות את התא לשקוע ב 1 מ"ל של PBS.
- ספירת תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר כחול טריפאן 0.4%. הוסף PBS כדי לדלל את התא ל 5 x 105 תאים לכל 100 μL. מניחים את התאים על קרח עד לשימוש.
3. חיסון חוץ רחמי של תאי B16F10-GP באזור המפשעה הדו-צדדי של עכברים
- שאפו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי B16F10-GP מוכן באמצעות מזרק 1 מ"ל. החלק את דופן הצינור כדי להזיז את הבועות למעלה ודחף את הבוכנה כדי להזיז את הבועה העליונה החוצה.
- החזק את העכבר במצב שכיבה, חושף את בטנו. לחץ על הגפה האחורית הימנית של העכבר במצב שכיבה עם אצבע, כך שהעור באזור המפשעה הימני חשוף במלואו (אותו דבר עם אזור המפשעה השמאלי).
- הסר את הפרווה על הבטן עם קרם depilatory, ולאחר מכן לנקות את אזור הבטן דו צדדית עם כותנה המכילה 75% אתנול.
- לפני החדרת המחט, ודא כי העור באזור המפשעה הוא הידק. הכנס את המחט בזווית של 45° בחלל התת עורי של האזור המפשעה של הירך העליונה. יש לוודא שהמחט משופעת כלפי מעלה ועומק המחט ל-0.5-1 ס"מ.
- החל יניקה עדינה לפני ההזרקה, אם אין דם, להזריק את התאים מוזרק לאט לתוך הרקמה תת עורית. במקביל, שימו לב בולוס קטן (היווצרות כיס נוזל) באזור התת עורי.
- לאחר ההזרקה, להסיר את המחט, לשים אותו בתיבת חדים, ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה.
4. העברה מאומצת של תאי P14 T לעכברים נושאי גידול
- לבצע העברה מאומצת בעכברים נושאי גידול 6-8 ימים לאחר השתלת הגידול, כאשר הגידולים מוחשיים (קוטר של כ-3-5 מ"מ). הזרקה תוך צפקית 4 מ"ג cyclophosphamide יום לפני ההעברה 28,29,30.
הערה: מטרת הזרקת CTX היא ליצור מקום בתא הלימפה עבור תאי T שהועברו באימוץ על ידי סילוק ארעי של לימפוציטים מתרבים. - בודדו לימפוציטים מהטחול ומה-LN של עכברים טרנסגניים תמימים מסוג P14 כמתואר להלן31,32 (בני 6-10 שבועות, מאותו המין כמו עכברים נושאי גידול כדי למנוע בעיות דחייה).
הערה: בצע את ההליכים הבאים בארון בטיחות ביולוגית כדי להבטיח תנאים סטריליים לחלוטין.- מכינים שתי מנות בקוטר 6 ס"מ ומוסיפים 3 מ"ל מדיום R2 לאחת המנות ו-3 מ"ל חיץ RBL למנה השנייה. הניחו מסנן תאים של 70 מיקרומטר בצלחת פטרי המכיל חיץ RBL.
- המתת חסד של עכברי P14 במיכלים אטומים המכילים איזופלורן ולאחר מכן נקע צוואר הרחם. התאם את מספר עכברי P14 בהתאם למספר העכברים המושתלים.
- קצרו את בלוטות הלימפה של הטחול, המפשעה ובית השחי מהעכברים שעברו המתת חסד והעבירו אותן לצלחות בקוטר 6 ס"מ המכילות 4 מ"ל של מדיום R2 ומונחות על קרח.
- מניחים את הטחול במסננת ספוגה עם 3 מ"ל של חיץ RBL, טוחנים את הטחול עם הפוטר בתוך מזרק 1 מ"ל. דגרו על התאים ב-RT למשך 1-2 דקות, ואז סיימו את התגובה עם 3 מ"ל של תווך R2 קר.
- טוחנים את ה-LNs עם הפוטר בתוך מזרק 1 מ"ל עד שרק רקמת חיבור נשארת במסננת עם מסנן תאים של 70 מיקרומטר. שטפו את המסנן בתווך R2 קר והעבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל. צנטריפוגה את הדגימות ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
- השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים עם 3 מ"ל של PBS. השתמש במסנן תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר חומר פלוקולנטי מתרחיף התא.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C. להשעות את התאים עם 3 מ"ל של PBS ולהניח את הצינור על קרח. קחו דגימה קטנה, ערבבו עם טריפאן כחול וספרו תאים באמצעות צלחת ספירת תאי דם.
- קבע את אחוז תאי P14 (חיים/מתים CD45.1+CD8+Vα2+) לפי ציטומטריית זרימה. ודא שתאי התורם המועברים מציגים סמן קונגני מובהק עם עכברים מושתלים (עכברי B6 נושאי גידול הם CD45.2+). בצע צביעה לפני ההעברה כדי לאמת את הפנוטיפ הנכון של התאים המועברים.
- הוסף 5 x 104- 1 x 105 תאים לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חיץ FACS. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 3 דקות.
- השליכו את הסופרנטנט, העבירו את תחתית הצינור כדי לפזר את התאים, והניחו את הצינור על קרח.
- הכינו את תערובת הנוגדנים המצומדים הבאה 9,32 מדוללת ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS: אנטי-CD8, 1:200; נגד TCR Vα2, 1:100; אנטי-CD45.1, 1:200; כתם חי/מת, 1:400. (טבלת חומרים).
- צנטריפוגה את תערובת הנוגדנים ב 15,000 x גרם במשך 3 דקות כדי לצבור את החלקיקים. מניחים את התערובת על קרח ומגנים עליה מפני אור על ידי עטיפתה בנייר כסף. קח רק את supernatant כדי למנוע את השאיפה של חלקיקים.
- להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של תערובת נוגדנים לערבב היטב על ידי הבהוב דופן הצינור. לאחר העטיפה בנייר כסף, דוגרים על הצינור במשך 30 דקות על קרח.
- שטוף את התאים 2x עם מאגר FACS. צנטריפוגה את הצינור ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 3 דקות. השהה מחדש את התאים עם 200 μL של מאגר FACS והעבר את תרחיף התא לצינור זרימה.
- הפעל את צינור הזרימה עם תאים מוכתמים על ציטומטר זרימה כדי לקבוע את אחוז התאים חיים/מתים CD45.1+CD8+Vα2+ .
הערה: באופן כללי, מעל 90% מתאי CD8+ T מעכברים טרנסגניים P14 היו בעלי Vα2 + TCRs, שהם ספציפיים ל- H-2Db GP33-41 אפיטופ של LCMV (וירוס כוריאומנינגיטיס לימפוציטי).
- חשב את המספר המוחלט של תאים חיים/מתים CD45.1+CD8+Vα2+ על ידי הכפלת האחוז שלו ומספר התא החי המתקבל בשלבים 4.2 ו- 4.3.
- שאפו 200 μL של תא P14 (5 x 105 תאים) השעיה עם מזרק אינסולין 100 U והסירו בועות. המספר הראשוני של תאי P14 נאיביים שהועברו (5 x 103 - 5 x 105) לא השפיע על הפנוטיפ של תאים שהועברו9.
- מניחים את העכברים בכלוב ומחממים עם מנורת אינפרא אדום למשך 5-10 דקות כדי להרחיב את וריד הזנב. החזק במקום עם קיבוע עכבר בגודל מתאים, יישר את הזנב ונגב אותו עם כדור צמר גפן המכיל 75% אתנול כדי להפוך את הוורידים גלויים.
- הכנס את המחט במקביל לווריד הזנב ומשוך בעדינות את הבוכנה. אם יש דם זורם לתוך המזרק, לאט לדחוף את השעיית התא לתוך הווריד.
הערה: אם יש התנגדות או נפיחות של הזנב במהלך ההזרקה, יש להתאים את תנוחת ההזרקה. אתר ההזרקה צריך להתחיל בקצה הדיסטלי. - לאחר השלמת ההזרקה, משוך את המחט במהירות ולחץ על מקום ההזרקה בעדינות עם כדור צמר גפן. להחזיר את העכבר לכלוב נקי חדש ולהתבונן בו מקרוב במשך מספר דקות עבור כל תופעות לוואי.
5. כריתה של הגידול הראשוני
הערה: יש לוודא שכל כלי הניתוח עוברים אוטוקלאבינג לפני השימוש. יש לעקר את אזור ההפעלה בתוך ארון הבטיחות הביולוגית באתנול 75%, ולאחר מכן לבצע הקרנת UV למשך 30 דקות לפחות. יש ללבוש חלוקים נקיים, כובעים, מסכות וכפפות סטריליות במהלך הניתוח.
- כאשר הגידול מוחשי (קוטר של כ-5 מ"מ), כורתים את הגידול הראשוני.
- מרדימים את העכברים בהזרקה תוך צפקית של קטמין (75 מ"ג/ק"ג). צבוט כרית כף רגל כדי להעריך את מידת ההרדמה, אם אין רפלקס כאב, זה מציין את העיתוי הנכון לניתוח. אם הגפיים האחוריות נסוגו, לספק מנה נוספת של 10-30 μL.
הערה: לחלופין, medetomidine intraperitoneal (1 מ"ג / ק"ג משקל גוף; דומיטור) מומלץ להרדים עכברים. - יש למרוח את המשחה למניעת ייבוש על עיני עכבר. הסר את הפרווה על הבטן עם קרם depilatory כדי לחשוף באופן מלא את שדה הניתוח.
- הניחו את העכבר בארון בטיחות ביולוגית והניחו אותו על לוח אנטומי מכוסה בנייר סופג נקי במצב שכיבה כך שציר האורך של העכבר מקביל לנסיין.
הערה: כדי לשמור על סביבה סטרילית קפדנית, יש לבצע את ההליכים הבאים בארון בטיחות ביולוגית. - לחטא את הבטן של העכברים עם כדור צמר גפן ספוג povidone-יוד. חותכים את העור ליד האתר הנושא את הגידול עם אזמל סטרילי או מספריים אופתלמיים. הכנס מספריים סגורים קצה לתוך החתך כדי לחשוף בבירור את הגידול. כאשר חותכים את העור, יש להקפיד שלא לפגוע בבלוטות הלימפה המפשעות.
- במהלך הסרת הגידול, יש לשמור על הקפסולה שלמה ככל האפשר. בזהירות ובעדינות להסיר את רקמת החיבור הצמודה לגידול עם מספריים סטריליים. הסר את הגידול באתרו לחלוטין, אחרת הוא עלול לחזור.
6. הזרקה תוך קשרית של תאי B16F10-GP בבלוטת הלימפה המפשעתית
הערה: לאחר פינוי הגידול הדו-צדדי, תאי B16F10-GP הוזרקו לבלוטת לימפה מפשעתית חד צדדית ו- PBS הוזרק לצד השני.
- שאפו 20 μL (5 x 104 תאים) של תרחיף תאי B16F10-GP עם מזרק אינסולין 100 U, הסירו בועות ואז הזריקו לבלוטת לימפה מפשעתית אחת. הזריקו נפח שווה של PBS לבלוטת הלימפה המפשעתית בצד השני.
- במהלך ההזרקה, הכנס את המחט מהקצה הדיסטלי של בלוטת הלימפה, ולאחר מכן הכנס לאט את המחט למרכז בלוטת הלימפה. בשלב זה, אם הנוזל מוזרק במדויק לתוך בלוטת הלימפה, בלוטת הלימפה ניתן לראות להתנפח באופן משמעותי.
הערה: כאשר המחט מוחדרת מהקצה הדיסטלי של בלוטת הלימפה, הקפד לא לנקב את הצומת.
- במהלך ההזרקה, הכנס את המחט מהקצה הדיסטלי של בלוטת הלימפה, ולאחר מכן הכנס לאט את המחט למרכז בלוטת הלימפה. בשלב זה, אם הנוזל מוזרק במדויק לתוך בלוטת הלימפה, בלוטת הלימפה ניתן לראות להתנפח באופן משמעותי.
- תפרו את החתך ב-2-3 תפרים בתפר 3-0. לחטא את העור סביב הפצע עם כותנה ספוג יוד פובידון. יש להקפיד לעקוף את בלוטות הלימפה במהלך התפר.
- הניחו את העכבר בכלוב נקי ושמרו על חום הגוף באמצעות אור אינפרא אדום במצב דקוביטוס רוחבי. יש לעקוב ברציפות עד להתאוששות ההכרה. ודא כי העכברים שעברו ניתוח לא יוחזרו לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
- תן buprenorphine כל 4-6 שעות במשך 3 ימים רצופים לאחר הניתוח כדי להקל על כאב לאחר הניתוח (במינון של 0.1-0.5 מ"ג / ק"ג, SQ או IP). עקוב אחר אזורי ההאכלה, השתייה, התנועה והפעילות של העכברים. בדרך כלל, עכברים מתאוששים מטראומה כירורגית תוך 3 ימים.
הערה: אם עכברים אינם מסוגלים לחזור להאכלה ולפעילות רגילה ומראים סימני זיהום, יש להתייעץ עם וטרינר להתערבות או להרדים אותם. - להקריב עכברים בנקודות זמן שונות: יום 8 ויום 18 לאחר הזרקה intranodal של תאים סרטניים. שחזור תאי תורם פעילים באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התרשים הסכמטי של תכנון ניסויי זה מוצג באיור 1A. סך של 5 x 105 תאי B16F10-GP ב 100 μL של PBS הושתלו תת עורית (s.c.) באזור המפשעה הדו-צדדי של עכברי CD45.2 C57BL/6J. לאחר 7 ימים, עכברים נושאי גידול אלה הוזרקו תוך צפקית (כלומר) עם 4 מ"ג CTX, ולאחר מכן העברה מאומצת של 5 x 105 CD45.1 + P14 תאים באמצעות הזרקת זנב תוך ורידי (i.v.). כאשר גידולים גדלו לקוטר של כ-3-5 מ"מ (כ-7 ימים לאחר העברת תאי P14), גידולים ראשוניים נכרתו, ו-5 x 104 תאי B16F10-GP ב-20 מיקרוליטר של PBS הוזרקו ישירות לבלוטת לימפה מפשעתית חד-צדדית. בלוטת הלימפה המפשעתית בצד השני הוזרקה עם כמויות שוות של PBS. צביעה מייצגת של המטוקסילין ואאוזין (H&E, 100x) של בלוטת הלימפה הלא גרורתית (nLN) ובלוטת הלימפה הגרורתית (mLN) בנקודות הזמן שצוינו מוצגת באיור 1B. המבנה של nLN היה שלם. בשלב המוקדם של גרורות LN (D8), mLN היה עסוק חלקית בתאי גידול (חץ שחור), ועדיין נותר אזור עם לימפוציטים שלא פלשו אליהם תאי הגידול (חץ אדום). בעוד בשלב מאוחר של גרורות LN (D18), mLN מלא תאים סרטניים מלווה אנגיוגנזה הגידול ולימפוציטים קטנים. תאי P14 פעילים שנמצאו ב- TdLN הפיקו רמה גבוהה של IFN-γ לאחר גירוי פפטידי GP33-41 9,31. כאן, האחוזים של תאי P14 פעילים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה בנקודות זמן שונות, ואסטרטגיית הגאטינג מוצגת באיור 2. השכיחות של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן בדם היקפי בשלב מוקדם (D8) ובשלב מאוחר (D18) היא 2.81% ו-1.48%, בהתאמה (איור 3A). דווח כי תאי T ספציפיים לגידול CD8+ שוכנים אך ורק ב- dLN במהלך הגידול ו- LN שאינו מנקז התאושש תאי תורם מוגבלים33. אחוז תאי P14 ספציפיים לאנטיגן ב-nLN היה יציב במהלך גרורות LN. באופן מסקרן, תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן ב-mLN קיבלו דחיפה זמנית בשלב המוקדם, עדות לכך היא התדירות הגבוהה יותר של תאי P14 בהשוואה ל-nLN, בעוד שהיא ירדה בחדות בשלב המאוחר (איור 3B).
איור 1: תרשים סכמטי של תכנון הניסוי. (A) עכברי C57BL/6J (CD45.2+) מושתלים עם 5 x 105 תאי גידול B16F10-GP באזור המפשעה הדו-צדדי. לאחר 7 ימים, עכברים אלה מוזרקים תוך צפקית עם CTX 4 מ"ג, ולאחר מכן העברה מאמצת של תאים שונים המסומנים קונגנית (CD45.1+) P14 למחרת. כאשר גידולים גדלים לקוטר של כ 3-5 מ"מ (כ -7 ימים לאחר העברת תאי P14), גידולים ראשוניים מנותחים, ואז 5 x 104 תאי B16F10-GP ב 20 μL של PBS מוזרקים ישירות לתוך בלוטת לימפה מפשעתית חד צדדית, ואת בלוטת הלימפה המפשעה בצד השני מוזרק עם כמויות שוות של PBS. (B) המטוקסילין ואאוסין מייצג (H&E,100x) צביעה של LNs. קיצורים: s.c. = תת עורי; CTX = cyclophosphamide; i.v. = תוך ורידי; שק = הקרבה; nLN = LN לא גרורתי; mLN = LN גרורתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיית Gating לניתוח ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית Gating המשמשת לזיהוי תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן פעיל שמקורם בתורם. קיצורים: L/D = חי/מת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דינמיקה של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות LN. חלקם של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן בדם היקפי , (B) nLN ו- mLN בנקודות זמן שונות. קיצורים: nLN = LN לא גרורתי; mLN = LN גרורתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך הגידול, תאים מציגי אנטיגן (APCs) בולעים אנטיגנים סרטניים ונודדים ל- TdLN שם הם ראשונים תאי CD8+ T. לאחר הפריימינג וההפעלה, תאי T CD8+ עוזבים את ה- TdLN וחודרים לגידול כדי להרוג תאי גידול10. באמצעות כריתת TdLN ומתן FTY720 אשר חוסמים את יציאת תאי החיסון מאיברי הלימפה, מספר מחקרים הוכיחו את התפקיד המרכזי של TdLN בהבטחת היעילות של טיפול בנקודות ביקורת PD-1/PD-L134,35. בהתאם לכך, לאחרונה מצאנו כי תאי זיכרון ספציפיים לגידול CD8+ T (TTSM) שוכנים בעיקר ב- TdLN, תאיTdLN-T TSM אלה משמשים כמגיבים בתום לב ל- ICB9. למרבה הצער, מספר סוגים של תאים סרטניים מתפשטים לעתים קרובות ל- TdLN מאתרי גידול ראשוניים, מה שמוביל לאישור מחדש מבני ולתפקוד לקוי של תאי מערכת החיסון ב- TdLNs. הכמות והאיכות הלקויה של תאי CD8+ T ב- mLN כבר תוארה20,36. עם זאת, השינויים הדינמיים של תאי CD8+ T, במיוחד תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול במהלך מפל LN גרורתי לא הובהרו.
כאן, פיתחנו מודל עכבר נוח לניטור הדינמיקה של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן מערכתי ומקומי במהלך תהליך גרורות LN. תאי מלנומה B16F10-GP הושתלו תת עורית באזור המפשעה הדו-צדדי, ולאחר מכן הועברו באופן מאומץ עם תאי P14 שיכולים להיות מופעלים באופן ספציפי על ידי הפפטיד GP33-41 שמקורו ב-GP. ביום 7 לאחר העברת התאים כאשר תאי P14 ב- LN מפשעתי הופעלו במלואם, גידולים ראשוניים בשני הצדדים נכרתו ותאי B16F10-GP הוזרקו ישירות ל- LN מפשעתי חד צדדי, ניתוח דמה בצד השני בוצע באמצעות הזריקה בנפחים שווים של PBS. תכנון גאוני זה מאפשר השוואה של תאי P14 ב-mLN ותאי LN לא גרורתיים (nLN) בתוך אותם עכברים. במקביל, תאי P14 בדם פריפריאלי בתוך אותם עכברים התגלו בנקודות זמן שונות במהלך גרורות LN על ידי דימום הווריד המסלולי. מלבד התדרים של תאי P14 בדם פריפריאלי ו- TdLN בשלבים שונים במהלך גרורות LN, ניתן היה להמשיך ולבחון את תכונות השעתוק והאפיגנטיות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן אלה באמצעות טכניקות אחרות.
יש לציין כי יש לבצע מספר שלבים בזהירות. ראשית, יש לכרות את הגידולים הראשוניים ביסודיות, מכיוון שתאי הגידול השיוריים יגדלו מחדש במהירות. שנית, יש לבצע את הניתוח בעדינות, שכן רקמות הגידול מכילות שפע של כלי דם חדשים אשר בדרך כלל נשברים באופן בלתי נמנע במהלך כריתת הגידול הראשונית ומובילים למוות של עכברים כירורגיים עקב דימום מסיבי. לכן, העיתוי של כריתת הגידול הראשונית הוא בעל חשיבות קריטית. בדרך כלל, זה בטוח יחסית להסיר אותו כאשר הגידול גדל לגודל של כ 5 x 5 מ"מ, ואת תאי הגידול יש להזריק במדויק לתוך LN ולא את התחתון או רקמות סמוכות. יתר על כן, נפח השעיית תאי הגידול צריך להיות נשלט מתחת 20 μL, אחרת שפיכה תיצור גידול חדש מחוץ LN. לבסוף, מגבלה של פרוטוקול זה היא שהניתוח הוא טראומטי, ועכברים עלולים לחוות זיהום במהלך תהליך הריפוי, אשר ישפיע על התכונות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן. לכן, חשוב ביותר לשמור על אספסיס קפדני במהלך הניתוח ויש לבצע הזרקת PBS המופעלת על ידי דמה כדי למנוע את ההשפעה של נזק פיזי הנגרם על ידי הזרקה לתאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.
בסך הכל, אנו מספקים מודל נוח לחקור את תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות LN וניתן להבהיר גם את האינטראקציות בין תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן לבין תאים חיסוניים אחרים או תאי סטרומה במהלך גרורות LN. בנוסף, ניתן להרחיב אותו בקלות למספר מודלים אחרים של גידולים. באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מציע מודל רבייה שימושי לחקר אימונולוגיה של סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים של סין (מס '82122028 ל- LX), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82173094 ל- LX), הקרן למדעי הטבע של צ'ונג צ'ינג (מס '2023NSCQ-BHX0087 ל- SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
