Summary
Den eksperimentelle designen som presenteres her gir en nyttig reproduksjonsmodell for studier av antigenspesifikke CD8+ T-celler under lymfeknute (LN) metastase, som utelukker forstyrrelse av tilskuer-CD8+ T-celler.
Abstract
Tumorantigenspesifikke CD8+ T-celler fra drenerende lymfeknuter får en akkumulerende betydning ved montering av antitumorimmunrespons under tumorigenese. Imidlertid danner kreftceller i mange tilfeller metastatiske loci i lymfeknuter før de metastaserer videre til fjerne organer. I hvilken grad de lokale og systematiske CD8+ T-celleresponsene ble påvirket av LN-metastase, er fortsatt uklart. For dette formål satte vi opp en murine LN-metastasemodell kombinert med en B16F10-GP melanomcellelinje som uttrykker surrogatneoantigenet avledet fra lymfocytisk choriomeningittvirus (LCMV), glykoprotein (GP) og P14 transgene mus som har T-cellereseptorer (TCR) som er spesifikke for GP-avledet peptid GP33-41 presentert av klasse I store histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyl H-2Db. Denne protokollen gjør det mulig å studere antigenspesifikke CD8+ T-celleresponser under LN-metastase. I denne protokollen ble C57BL/6J-mus subkutant implantert med B16F10-GP-celler, etterfulgt av adoptivoverføring med naive P14-celler. Da subkutan tumor vokste til ca. 5 mm i diameter, ble primærtumor skåret ut, og B16F10-GP-celler ble injisert direkte i tumordrenerende lymfeknute (TdLN). Deretter ble dynamikken til CD8 + T-celler overvåket under prosessen med LN-metastase. Samlet har denne modellen gitt en tilnærming til nøyaktig å undersøke de antigenspesifikke CD8 + T-celleimmunresponsene under LN-metastase.
Introduction
Kreftimmunterapi, spesielt immunsjekkpunktblokaden (ICB), har revolusjonert kreftbehandling1. ICB blokkerer de koinhibitoriske immunreseptorene (som PD-1, Tim-3, LAG-3 og TIGIT), som er sterkt uttrykt i utmattede CD8 + T-celler i tumormikromiljøet (TME), noe som fører til gjenopplivning av utmattede CD8 + T-celler2. Tatt i betraktning heterogeniteten til utmattede CD8 + T-celler, viste akkumulerende bevis at tumorspesifikke CD8 + T-celler avledet fra periferien, inkludert drenering av lymfeknute (dLN), men ikke i TME, medierer effekten av ICB 3,4,5,6,7,8. Nylig ble TdLN-avledede TCF-1 + TOX-tumorspesifikke CD8 + T-celler (TdLN-TTSM) bekreftet å være de ekte responderne på ICB som legemliggjør flere funksjonelle egenskaper til konvensjonelle minne T-celler og kan ytterligere utvide og differensiere til avkom, utmattede celler ved ICB-behandling9. Samlet sett bekreftet disse funnene betydningen av LN i montering av antitumorimmunitet.
Lymfeknute fungerer som et kritisk sted for å lette priming og aktivering av tumorspesifikke CD8 + T-celler ved å gi strukturelt grunnlag så vel som biologiske signaler10. Flere typer kreftceller frø ofte vaktpostlymfeknute (SLN, den første LN som drenerer en primærtumor) før systematisk spredning11. Tilstedeværelsen av SLN-metastase er knyttet til dårlig utfall i human kreft, og prekliniske modeller viste at tumorceller i TdLN kunne spre seg til fjerne organer gjennom både lymfekar og blodkar i noden 12,13,14,15. SLN-biopsi representerer nå en standardprosedyre for å veilede etterfølgende behandlingsbeslutninger i mange solide tumortyper som kan unngå unødvendig reseksjon av uinvolvert LN16,17. Selv for den involverte LN er det fortsatt kontroversielt om og når kirurgisk reseksjon er nødvendig, da flere studier har vist at fjerning av regional LN ikke viste forbedret totaloverlevelse sammenlignet med de som fikk stråling eller systemisk behandling uten regional LN-reseksjon 18,19. En tolkning er at metastatisk LN (mLN) med mikroskopisk sykdom kan beholde en viss kapasitet til å utdanne immunceller og gi noen terapeutiske fordeler. Så det er kritisk viktig å belyse hvordan LN-metastase påvirker antitumorimmunresponsen, spesielt egenskapene og funksjonene til TdLN-TTSM.
Hittil har både prekliniske og kliniske data avslørt noen strukturelle og cellulære endringer i mLN20. Imidlertid er de dynamiske endringene av tumorspesifikke CD8 + T-celler under LN-metastase ikke avgrenset. Derfor er det nødvendig å utvikle en overbevisende modell for LN-metastase for videre undersøkelse. Faktisk har flere studier rapportert mLN musemodeller på forskjellige måter 14,21,22. For eksempel ble spontan metastase i aksillære LN utført ved implantasjon av 4T1 brystkreftceller i brystfettputen22. I en annen studie genererte Reticker-Flynn et al. melanomcellelinjer med høy forekomst av spredning fra subkutan primærtumor til LN gjennom seriell inokulering av tumorceller dyrket fra dissosiert mLN-vev (ni runder)14. En annen vanlig modell ble utarbeidet ved injeksjon av tumorceller i fotputen, og metastatiske loci ville bli dannet i popliteal LN22. Spesielt er det vanskelig å evaluere de nøyaktige tidspunktene for intervensjon fordi LN-metastase i disse modellene ikke alltid er trofast.
I denne studien ble en murine LN-metastatisk modell etablert gjennom intranodal injeksjon av B16F10-GP-celler23,24, generert ved CRISPR/Cas9-mediert innsetting av LCMV-virusglykoprotein (GP) gensekvens i genomet til B16F10-cellelinje9. Deretter ble disse musene overført med P14-celler som har transgene T-cellereseptorer (TCR) som spesifikt gjenkjenner H-2Db GP33-41-epitopen 25,26 og den systemiske og lokale dynamikken til antigenspesifikke CD8 + T-celler under LN-metastase kunne undersøkes. Vår eksperimentelle design gir en nyttig modell for studiet av immunresponser, spesielt de antigenspesifikke CD8 + T-cellene under LN-metastasen som utelukker forstyrrelsen av tilskuer-CD8 + T-celler. Disse resultatene vil påvirke de kliniske behandlingsalternativene for å fjerne eller beholde mLN og kaste nytt lys over manipulering av mLN for å oppnå maksimal terapeutisk nytte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J-musene (referert til B6-mus) og naive P14-transgene mus 9,27 som ble brukt var 6-10 ukers alder som veide 18-22 g. Både mann og kvinne ble inkludert uten randomisering eller blinding. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Qingdao Agricultural University.
1. Fremstilling av medium og reagenser
- Forbered B16F10-GP melanom cellekulturmedium, kalt D10 (komplett DMEM medium) ved å legge til DMEM, 10% føtal bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin med ytterligere 100 U / ml puromycin. Vedlikehold en steril D10 og oppbevar den i opptil 2 uker ved 2-4 °C.
- Forbered R2 medium (for avslutning av røde blodlegemer) ved å legge til RPMI-1640 med 2% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin.
- Forbered fluorescensaktivert cellesorteringsbuffer (FACS) ved å tilsette 1x fosfatbufret saltvann (PBS) med 2% FBS og 0,01% natriumazid. Tilsetningen av natriumazid kan forlenge lagringstiden til FACS-bufferen, som kan lagres i måneder ved 2-4 ° C.
- Forbered buffer for rød blodcellelyse (RBL) ved å tilsette 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i dobbeltdestillert vann og juster pH til 7,3. Oppbevar RBL-bufferen ved romtemperatur (RT), og den forblir stabil i opptil 3 måneder.
- Forbered bedøvelsen, 2,2,2-tribromoetanol, som beskrevet nedenfor.
- Vei ut passende mengde 2,2,2-tribromoetanolkrystall i et 50 ml sterilt konisk rør innpakket med aluminiumsfolie. Tilsett passende mengde 2-metyl-2-butanol i krystallet for å fremstille stamløsningen med en konsentrasjon på 500 mg/ml.
- Roter den for å blande og varme slangen i et vannbad på 37 °C til krystallen er oppløst. Pass på at alle krystaller er oppløst.
- Bland løsningen grundig. Filtrer stamløsningen med et 0,22 μm filter i en steril beholder. Oppbevar stamoppløsningen frossen, skjermet mot lys, ved -20 °C eller fortynn med PBS til en arbeidsløsning i en konsentrasjon på 12,5 mg/ml og oppbevart ved 4 °C.
MERK: Det er best å bruke den foreskrevne konsentrasjonen, da høyere konsentrasjoner av væsken er irriterende.
2. Fremstilling av B16F10-GP cellesuspensjon
- Tining og dyrkning av et hetteglass med 1 x 106 B16F10-GP-celler med 5 ml D10 i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Subkulturceller når de nådde 80% til 90% tetthet som beskrevet nedenfor.
- Kast det opprinnelige kulturmediet ved aspirasjon med en pipetteringspistol og vask cellene 2x med PBS. Når du rengjør adherente celler med PBS i en cellekulturskål, flytt PBS til sidevæggen eller slipp den i parabolen.
- Etter aspirasjon av PBS, tilsett 0,5-1 ml 0,25% trypsin EDTA-løsning til cellekulturskålen eller kolben. Rist forsiktig for å dekke hele celleoverflaten. Plasser cellekulturfatet eller kolben i en inkubator ved 37 °C i ca. 1 min eller ved RT til cellene er avrundet og separert. Vær oppmerksom på peeling av celler ved hjelp av et omvendt mikroskop.
- Tilsett like volum nyformulert D10 for å avslutte trypsinfordøyelsen. Rens den nedre overflaten av cellekulturkolben med en pipetteringspistol for å sikre at alle celler ble separert.
- Overfør B16F10-GP-cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 163 x g i 4 minutter ved RT.
- Aspirer supernatanten og kast. Resuspender cellene i 1-2 ml D10 for nedbør. Overfør B16F10-GP-cellesuspensjon til en ny cellekulturskål eller kolbe inneholdende 8-10 ml D10 og inkuber deretter i en celleinkubator ved 37 °C ved 5% CO2.
- På dagen for tumorimplantasjon, samle B16F10-GP-celler med en tetthet på ca. 90% som beskrevet i trinn 2.1.1 til 2.1.4. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten og kast. Resuspender celleutfellingen i 1 ml PBS.
- Telle levedyktige celler ved hjelp av en 0,4% trypan blå hemocytometer. Legg til PBS for å fortynne cellen til 5 x 105 celler per 100 μL. Plasser cellene på is til bruk.
3. Ektopisk inokulering av B16F10-GP-celler i den bilaterale lyskeregionen hos mus
- Aspirer 100 mikrol klargjort B16F10-GP cellesuspensjon ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Sveip rørveggen for å flytte boblene til toppen, og skyv stempelet for å flytte toppboblen ut.
- Hold musen i en liggende stilling, og utsett magen. Trykk på høyre bakre lem av musen i liggende stilling med en finger slik at huden i høyre lyskeregion er fullt eksponert (Samme med venstre lyskeregion).
- Fjern pelsen på magen med hårfjerningskrem, rengjør deretter det bilaterale mageområdet med bomull som inneholder 75% etanol.
- Før du setter inn nålen, må du kontrollere at huden i inngangsregionen er strammet. Stikk nålen i en 45° vinkel i det subkutane rommet i lyskeregionen på øvre del av låret. Pass på at nålen er skråstilt oppover og dybden på nålen til 0,5-1 cm.
- Påfør forsiktig suging før injeksjon, hvis det ikke er blod, injiser cellene sakte injisert i det subkutane vevet. Samtidig observere en liten bolus (dannelse av væskelomme) i det subkutane området.
- Etter injeksjon, fjern nålen, legg den i boksen for skarpe gjenstander og sett musen tilbake i buret.
4. Adoptivoverføring av P14 T-celler til tumorbærende mus
- Utfør adoptivoverføring i tumorbærende mus 6-8 dager etter tumorimplantasjon, når svulstene er palpable (ca. 3-5 mm i diameter). Intraperitonealt injiser 4 mg cyklofosfamid dagen før overføring 28,29,30.
MERK: Målet med CTX-injeksjon er å skape plass i lymferommet for adoptivoverførte T-celler ved forbigående å eliminere prolifererende lymfocytter. - Isoler lymfocytter fra milten og LN hos naive P14 transgene mus som beskrevet nedenfor31,32 (6-10 uker gamle, samme kjønn som tumorbærende mus for å unngå avstøtningsproblemer).
MERK: Utfør følgende prosedyrer i et biosikkerhetsskap for å sikre strengt sterile forhold.- Forbered to 6 cm retter og tilsett 3 ml R2 medium til en av rettene og 3 ml RBL-buffer til den andre retten. Plasser et 70 μm cellefilter i petriskålen som inneholder RBL-buffer.
- Avliving av P14-mus i lufttette beholdere som inneholder isofluran etterfulgt av cervikal dislokasjon. Juster antall P14-mus i henhold til antall mottakermus.
- Høst milt-, lyske- og aksillære lymfeknuter fra de avlivede musene og overfør dem til 6 cm fat som inneholder 4 ml R2 medium og legges på is.
- Plasser milten i en sil dynket med 3 ml RBL-buffer, slip milten med putteren inne i 1 ml sprøyten. Inkuber cellene ved RT i 1-2 minutter, og avslutt deretter reaksjonen med 3 ml kaldt R2-medium.
- Mal LN-ene med putteren inne i 1 ml sprøyten til bare bindevev er igjen i silen med et 70 μm cellefilter. Skyll filteret med kaldt R2-medium og overfør cellesuspensjonen til et nytt 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger prøvene ved 500 x g i 6 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspender cellene med 3 ml PBS. Bruk et 70 μm cellefilter for å fjerne flokkulent materiale fra cellesuspensjonen.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 x g i 6 minutter ved 4 °C. Resuspender cellene med 3 ml PBS og legg røret på is. Ta en liten prøve, bland med trypanblått, og tell celler ved hjelp av en blodcelletellingsplate.
- Bestem prosentandelen av P14 (live/dead-CD45.1+CD8+Vα2+) celler ved flowcytometri. Sørg for at de overførte donorcellene utviser tydelig congenic markør med mottakermus (tumorbærende B6-mus er CD45.2+). Utfør farging før overføring for å verifisere riktig fenotype av de overførte cellene.
- Legg til 5 x 104- 1 x 105 celler til et 1,5 ml sentrifugerør inneholdende 1 ml FACS-buffer. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 x g ved 4 °C i 3 minutter.
- Kast supernatanten, knips bunnen av røret for å spre cellene, og legg røret på is.
- Klargjør følgende konjugerte antistoffblanding 9,32 fortynnet i 100 mikrol FACS-buffer: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Levende/død beis, 1:400. (Materialfortegnelse).
- Sentrifuger antistoffblandingen ved 15 000 x g i 3 minutter for å aggregere partiklene. Legg blandingen på is og skjerme den mot lys ved å pakke den inn i folie. Ta bare supernatanten for å unngå aspirasjon av partikler.
- Resuspender cellene i 100 μL av antistoffblandingen og bland grundig ved å flikke rørveggen. Etter innpakning i tinnfolie, inkuber røret i 30 minutter på is.
- Vask cellene 2x med FACS-buffer. Sentrifuger røret ved 500 x g ved 4 °C i 3 minutter. Resuspender cellene med 200 μL FACS-buffer og overfør cellesuspensjonen til et strømningsrør.
- Kjør strømningsrøret med fargede celler på et flowcytometer for å bestemme prosentandelen av levende / døde-CD45.1 + CD8 + Vα2 + celler.
MERK: Generelt hadde over 90% av CD8 + T-celler fra P14 transgene mus Vα2 + TCR, som er spesifikke for H-2Db GP33-41 epitop av LCMV (lymfocytisk choriomeningittvirus).
- Beregn det absolutte antallet levende/døde-CD45.1+CD8+Vα2+-celler ved å multiplisere prosentandelen og det levende celletallet som er oppnådd i trinn 4.2 og 4.3.
- Aspirer 200 mikrol P14-celle (5 x 105 celler) suspensjon med en 100 E insulinsprøyte og fjern bobler. Det opprinnelige antallet overførte naive P14-celler (5 x 103 - 5 x 105) påvirket ikke fenotypen til overførte celler9.
- Plasser musene i et bur og varm med en infrarød lampe i 5-10 minutter for å utvide halevenen. Hold på plass med en passende størrelse musefikser, rett halen og tørk den med en bomullsdott som inneholder 75% etanol for å gjøre venene synlige.
- Sett nålen parallelt med halevenen og trekk stempelet forsiktig tilbake. Hvis det strømmer blod inn i sprøyten, skyv sakte cellesuspensjonen inn i venen.
MERK: Hvis det er motstand eller hevelse i halen under injeksjonen, må injeksjonsposisjonen justeres. Injeksjonsstedet skal starte i den distale enden. - Etter at injeksjonen er fullført, trekk nålen raskt ut og trykk forsiktig på injeksjonsstedet med en bomullsdott. Sett musen tilbake til et nytt rent bur og observer det nøye i flere minutter for eventuelle bivirkninger.
5. Reseksjon av primærtumor
MERK: Forsikre deg om at alle kirurgiske instrumenter er autoklavert før bruk. Steriliser driftsområdet inne i biosikkerhetsskapet med 75% etanol, etterfulgt av UV-bestråling i minst 30 minutter. Bruk rene kjoler, hatter, masker og sterile hansker under operasjonen.
- Når svulsten er palpabel (ca. 5 mm i diameter), resect den primære svulsten.
- Bedøv musene med intraperitoneal injeksjon av ketamin (75 mg / kg). Klem fotpute for å evaluere graden av anestesi, hvis det ikke er smerterefleks, indikerer det riktig tidspunkt for kirurgi. Hvis bakre lemmer ble trukket tilbake, gi en annen dose på 10-30 μL.
MERK: Alternativt intraperitonealt medetomidin (1 mg/kg kroppsvekt; Domitor) anbefales å bedøve mus. - Påfør den tørkeforebyggende salven på museøynene. Fjern pelsen på magen med hårfjerningskrem for å eksponere det kirurgiske feltet fullt ut.
- Plasser musen i et biosikkerhetsskap og legg den på et anatomisk brett dekket med rent absorberende papir i liggende stilling, slik at musens lengdeakse er parallell med eksperimentøren.
MERK: For å opprettholde et strengt sterilt miljø, må følgende prosedyrer utføres i et biosikkerhetsskap. - Desinfiser magen til musene med en bomullsboll gjennomvåt i povidon-jod. Snitt huden nær det tumorbærende stedet med en steril skalpell eller opthalmisk saks. Sett inn lukket saks spissen inn i snittet for å tydelig eksponere svulsten. Når du snitter huden, sørg for ikke å skade inguinal lymfeknuter.
- Under fjerning av svulsten, hold kapselen så intakt som mulig. Fjern forsiktig og forsiktig bindevevet ved siden av svulsten med steril saks. Fjern svulsten in situ helt, ellers kan den gjenta seg.
6. Intranodal injeksjon av B16F10-GP-celler i inguinal lymfeknute
MERK: Etter bilateral tumorclearance ble B16F10-GP-celler injisert i unilateral inguinal lymfeknute og PBS ble injisert i den andre siden.
- Aspirat 20 μL (5 x 104 celler) B16F10-GP cellesuspensjon med en 100 E insulinsprøyte, fjern bobler og injiser deretter i en lyskeknute. Injiser et likt volum PBS i lyskelymfeknuten på den andre siden.
- Under injeksjonen, sett nålen fra den distale enden av lymfeknudepunktet, og sett deretter nålen sakte inn i midten av lymfeknudepunktet. På denne tiden, hvis væsken er nøyaktig injisert i lymfeknudepunktet, kan lymfeknuten sees å svulme betydelig.
MERK: Når nålen settes inn fra den distale enden av lymfeknuten, må du ikke punktere knuten.
- Under injeksjonen, sett nålen fra den distale enden av lymfeknudepunktet, og sett deretter nålen sakte inn i midten av lymfeknudepunktet. På denne tiden, hvis væsken er nøyaktig injisert i lymfeknudepunktet, kan lymfeknuten sees å svulme betydelig.
- Sutur snittet med 2-3 masker ved hjelp av en 3-0 sutur. Desinfiser huden rundt såret med bomull impregnert med povidonjod. Pass på å omgå lymfeknuter under suturering.
- Plasser musen i et rent bur og hold varmen ved hjelp av infrarødt lys i lateral decubitusposisjon. Overvåk kontinuerlig til bevisstheten er gjenopprettet. Sørg for at musene som har gjennomgått kirurgi, ikke returneres til selskap med andre dyr før de er fullstendig gjenopprettet.
- Gi buprenorfin hver 4-6 time i 3 påfølgende dager etter operasjonen for å lindre postoperativ smerte (i en dose på 0,1-0,5 mg/kg, SQ eller IP). Overvåk fôring, drikking, bevegelse og aktivitetsområder av musene. Vanligvis gjenoppretter mus fra kirurgisk traumer innen 3 dager.
MERK: Hvis mus ikke klarer å gjenoppta normal fôring og aktiviteter og viser tegn på infeksjon, kontakt en veterinær for intervensjon eller avlive den. - Ofre mus på forskjellige tidspunkter: dag 8 og dag 18 etter intranodal injeksjon av tumorceller. Gjenopprett aktiverte donorceller ved hjelp av flowcytometrianalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det skjematiske diagrammet til dette eksperimentelle designet er vist i figur 1A. Totalt 5 x 105 B16F10-GP-celler i 100 μL PBS ble subkutant (s.c.) implantert i den bilaterale lyskeregionen av CD45.2 C57BL/6J-mus. Etter 7 dager ble disse tumorbærende musene intraperitonealt (i.p.) injisert med 4 mg CTX, etterfulgt av adoptivoverføring av 5 x 105 CD45.1 + P14-celler gjennom intravenøs injeksjon i halen. Ved tumorvekst til ca. 3-5 mm i diameter (ca. 7 dager etter overføring av P14-celler) ble primærtumorer resektert, og 5 x 104 B16F10-GP-celler i 20 μL PBS ble injisert direkte i ensidig lyskelymfeknute. Lyskeknuten på den andre siden ble injisert med like store mengder PBS. Representativ hematoksylin- og eosinfarging (H&E, 100x) av ikke-metastatisk lymfeknute (nLN) og metastatisk lymfeknute (mLN) ved angitte tidspunkt er vist i figur 1B. Strukturen til nLN var intakt. I tidlig fase av LN-metastasen (D8) var mLN delvis opptatt med tumorceller (svart pil), og det er fortsatt noe gjenværende område med lymfocytter som ikke er invadert av tumorceller (rød pil). Mens i sen fase av LN-metastase (D18) er mLN fylt med tumorceller ledsaget av tumorangiogenese og små lymfocytter. Aktiverte P14-celler gjenfunnet i TdLN ga høyt nivå av IFN-γ etter GP33-41 peptidstimulering 9,31. Her ble prosentandelene aktiverte P14-celler analysert gjennom flowcytometri ved ulike tidspunkter, og gatingstrategien er vist i figur 2. Frekvensen av antigenspesifikke CD8+ T-celler i perifert blod i tidlig stadium (D8) og sent stadium (D18) er henholdsvis 2,81 % og 1,48 % (figur 3A). Tumorspesifikke CD8 + T-celler har blitt rapportert å strengt oppholde seg i dLN under tumorigenese og ikke-drenerende LN-gjenvunnede begrensede donorceller33. Prosentandelen antigenspesifikke P14-celler i nLN var stabil under LN-metastase. Oppsiktsvekkende nok ble antigenspesifikke CD8+ T-celler i mLN forbigående forsterket på et tidlig stadium, dokumentert av den høyere frekvensen av P14-celler sammenlignet med nLN, mens den ble kraftig redusert på sent stadium (figur 3B).
Figur 1: Skjematisk diagram over eksperimentelt design. (A) C57BL/6J mus (CD45.2+) er implantert med 5 x 105 B16F10-GP tumorceller på den bilaterale lyskeregionen. Etter 7 dager injiseres disse musene intraperitonealt med 4 mg CTX, og etterfulgt av adoptivoverføring av forskjellige medfødt merkede (CD45.1+) P14-celler neste dag. Når svulster vokser til ca. 3-5 mm i diameter (ca. 7 dager etter P14-celleoverføring), resekteres primære svulster, deretter injiseres 5 x 104 B16F10-GP-celler i 20 μL PBS direkte i ensidig inguinal lymfeknute, og inguinal lymfeknute på den andre siden injiseres med like store mengder PBS. (B) Representativ hematoksylin og eosin (H&E,100x) farging av LN. Forkortelser: s.c. = subkutan; CTX = cyklofosfamid; i.v. = intravenøs; Sac = offer; nLN = ikke-metastatisk LN; mLN = metastatisk LN. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gating strategi for flowcytometrianalyse. Gating strategi brukes til å identifisere donor-avledede aktivert antigen-spesifikke CD8 + T-celler. Forkortelser: L/D = levende/død. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dynamikk av antigenspesifikke CD8+ T-celler under LN-metastase. Andelen antigenspesifikke CD8+ T-celler i (A) perifert blod, (B) nLN og mLN på forskjellige tidspunkter. Forkortelser: nLN = ikke-metastatisk LN; mLN = metastatisk LN. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under tumorigenese sluker antigenpresenterende celler (APCer) tumorantigener og migrerer til TdLN hvor de primer CD8 + T-celler. Etter priming og aktivering forlater CD8 + T-celler TdLN og infiltrerer svulsten for å drepe tumorceller10. Gjennom TdLN-reseksjon og administrering av FTY720 som blokkerer utgangen av immunceller fra lymfoide organer, har flere studier vist den sentrale rollen til TdLN for å sikre effekten av PD-1 / PD-L1 sjekkpunktbehandling34,35. I samsvar med dette fant vi nylig at tumorspesifikke minne CD8 + T-celler (TTSM) hovedsakelig ligger i TdLN, disse TdLN-TTSM-cellene fungerer som bona fide-respondere på ICB9. Dessverre sprer flere typer kreftceller seg ofte til TdLN fra primære tumorsteder, noe som fører til strukturell bekreftelse og immuncelledysfunksjon i TdLN. Den svekkede mengden og kvaliteten på CD8+ T-celler i mLN er allerede beskrevet20,36. De dynamiske endringene i CD8+ T-celler, spesielt tumorantigenspesifikke CD8+ T-celler under LN-metastatisk kaskade, er imidlertid ikke klarlagt.
Her utviklet vi en praktisk musemodell for å overvåke dynamikken til systemiske og lokale antigenspesifikke CD8+ T-celler under prosessen med LN-metastase. B16F10-GP melanomceller ble subkutant implantert i den bilaterale lyskeregionen, etterfulgt av adoptivoverføring med P14-celler som spesifikt kunne aktiveres av det GP-avledede peptidet GP33-41. Ved dag 7 etter celleoverføring når P14-celler i lyske-LN var fullt aktivert, primære svulster i begge sider ble resektert og B16F10-GP-celler ble injisert direkte i ensidig lyske-LN, ble det utført narreoperasjon på den andre siden gjennom injeksjonen med like store volumer PBS. Denne geniale designen gjør det mulig å sammenligne P14-celler i mLN og ikke-metastatisk LN (nLN) i de samme musene. Samtidig ble P14-celler i periferiblod i de samme musene detektert på forskjellige tidspunkter under LN-metastase ved blødning i orbitalvenen. Bortsett fra frekvensene av P14-celler i periferiblod og TdLN på forskjellige stadier under LN-metastase, kan transkripsjonelle og epigenetiske egenskaper til disse antigenspesifikke CD8 + T-cellene undersøkes videre med andre teknikker.
Merk at flere trinn bør utføres forsiktig. For det første bør de primære svulstene skåret grundig ut, da de resterende tumorcellene vil vokse raskt igjen. For det andre bør operasjonen utføres forsiktig, da tumorvev inneholder rikelig med nye blodkar som vanligvis uunngåelig brytes under primær tumorreseksjon og fører til død av kirurgiske mus på grunn av massiv blødning. Derfor er tidspunktet for primærtumorreseksjon kritisk viktig. Generelt er det relativt trygt å fjerne det når svulsten vokser til størrelsen ca. 5 x 5 mm, og tumorceller skal injiseres nøyaktig i LN i stedet for bunnen eller tilstøtende vev. Videre bør volumet av tumorcellesuspensjoner kontrolleres under 20 μL, ellers vil utslipp danne ny tumor utenfor LN. Til slutt er en begrensning av denne protokollen at operasjonen er traumatisk, og mus kan oppleve infeksjon under helbredelsesprosessen, noe som vil påvirke egenskapene til antigenspesifikke CD8 + T-celler. Derfor er det kritisk viktig å opprettholde streng asepsis under operasjonen, og narreoperert PBS-injeksjon bør gjøres for å utelukke virkningen av injeksjonsindusert fysisk skade på antigenspesifikke CD8 + T-celler.
Samlet sett gir vi en praktisk modell for å undersøke antigenspesifikke CD8 + T-celler under LN-metastase, og interaksjonene mellom antigenspesifikke CD8 + T-celler og andre immunceller eller stromaceller under LN-metastase kan også belyses. I tillegg kan den lett utvides til flere andre tumormodeller. Samlet gir denne protokollen en nyttig reproduktiv modell for studiet av kreftimmunologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr. 82122028 til LX), National Natural Science Foundation of China (nr. 82173094 til LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr. 2023NSCQ-BHX0087 til SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
