Summary
يوفر التصميم التجريبي المعروض هنا نموذجا تناسليا مفيدا لدراسات الخلايا التائية CD8+ الخاصة بمولد الضد أثناء ورم خبيث في العقدة الليمفاوية (LN) ، والذي يستبعد اضطراب خلايا CD8+ T المتارة.
Abstract
تكتسب الخلايا التائية CD8 + T الخاصة بمستضد الورم من تصريف الغدد الليمفاوية أهمية متراكمة في تصاعد الاستجابة المناعية المضادة للورم أثناء تكوين الأورام. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، تشكل الخلايا السرطانية مواضع نقيلية في الغدد الليمفاوية قبل أن تنتقل إلى أعضاء بعيدة. إلى أي مدى تأثرت استجابات الخلايا التائية CD8 + المحلية والمنهجية بورم خبيث LN لا يزال غامضا. تحقيقا لهذه الغاية ، أنشأنا نموذج ورم خبيث LN الفئران جنبا إلى جنب مع خط خلايا سرطان الجلد B16F10-GP الذي يعبر عن المستضد الجديد البديل المشتق من فيروس التهاب المشيمية اللمفاوي (LCMV) ، والبروتين السكري (GP) ، والفئران المعدلة وراثيا P14 التي تؤوي مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) الخاصة بالببتيد المشتق من GP GP33-41 المقدم من جزيء معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) H-2Db. يتيح هذا البروتوكول دراسة استجابات الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN. في هذا البروتوكول ، تم زرع الفئران C57BL / 6J تحت الجلد بخلايا B16F10-GP ، تليها النقل بالتبني بخلايا P14 الساذجة. عندما نما الورم تحت الجلد إلى قطر 5 مم تقريبا ، تم استئصال الورم الرئيسي ، وتم حقن خلايا B16F10-GP مباشرة في العقدة الليمفاوية التي تستنزف الورم (TdLN). بعد ذلك ، تمت مراقبة ديناميكيات الخلايا التائية CD8 + أثناء عملية ورم خبيث LN. بشكل جماعي ، قدم هذا النموذج نهجا للتحقيق بدقة في الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN.
Introduction
أحدث العلاج المناعي للسرطان ، وخاصة حصار نقاط التفتيش المناعية (ICB) ، ثورة في علاج السرطان1. يمنع ICB المستقبلات المناعية المثبطة (مثل PD-1 و Tim-3 و LAG-3 و TIGIT) ، والتي يتم التعبير عنها بشكل كبير في خلايا CD8 + T المنهكة في البيئة المكروية للورم (TME) ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية CD8 + T المنهكة2. بالنظر إلى عدم تجانس خلايا CD8 + T المستنفدة ، كشفت الأدلة المتراكمة أن خلايا CD8 + T الخاصة بالورم المشتقة من المحيط ، بما في ذلك تصريف العقدة الليمفاوية (dLN) ، ولكن ليس في TME ، تتوسط في فعالية ICB3،4،5،6،7،8. في الآونة الأخيرة ، تم تأكيد أن الخلايا التائية CD8 + T المشتقة من TdLN المشتقة من TCF-1 + TOX (TdLN-TTSM) هي المستجيبون الحقيقيون ل ICB التي تجسد العديد من الخصائص الوظيفية للخلايا التائية للذاكرة التقليدية ويمكن أن تتوسع وتتمايز إلى خلايا مستنفدة من ذرية عند علاج ICB9. إجمالا ، أكدت هذه النتائج أهمية LN في بناء مناعة مضادة للورم.
تعمل العقدة الليمفاوية كمكان حاسم في تسهيل تحضير وتنشيط خلايا CD8 + T الخاصة بالورم من خلال توفير الأساس الهيكلي وكذلك الإشارات البيولوجية10. تقوم عدة أنواع من الخلايا السرطانية في كثير من الأحيان بزرع العقدة الليمفاوية الخافرة (SLN ، أول LN يستنزف ورما أوليا) قبل النشر المنهجي11. يرتبط وجود ورم خبيث SLN بنتائج سيئة في سرطان الإنسان وأظهرت النماذج قبل السريرية أن الخلايا السرطانية في TdLN يمكن أن تنتشر إلى أعضاء بعيدة من خلال كل من الأوعية اللمفاوية والأوعية الدموية للعقدة12،13،14،15. تمثل خزعة SLN الآن إجراء قياسيا لتوجيه قرارات العلاج اللاحقة في العديد من أنواع الأورام الصلبة التي يمكن أن تتجنب الاستئصال غير الضروري ل LN16,17 غير المتورط. حتى بالنسبة إلى LN المعنية ، لا يزال من المثير للجدل ما إذا كانت هناك حاجة إلى الاستئصال الجراحي ومتى حيث أظهرت العديد من الدراسات أن إزالة LN الإقليمية لم تظهر تحسنا في البقاء على قيد الحياة بشكل عام مقارنة بأولئك الذين تلقوا العلاج الإشعاعي أو الجهازي دون استئصال LN الإقليمي18,19. أحد التفسيرات هو أن LN النقيلي (mLN) المصاب بمرض مجهري قد يحتفظ ببعض القدرة على تثقيف الخلايا المناعية وتوفير بعض الفوائد العلاجية. لذلك ، من المهم للغاية توضيح كيفية تأثير ورم خبيث LN على الاستجابة المناعية المضادة للورم ، وخاصة خصائص ووظائف TdLN-TTSM.
حتى الآن ، كشفت كل من البيانات قبل السريرية والسريرية عن بعض التغييرات الهيكلية والخلوية في mLN20. ومع ذلك ، لم يتم تحديد التغييرات الديناميكية لخلايا CD8 + T الخاصة بالورم أثناء ورم خبيث LN. لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير نموذج مقنع لورم خبيث LN لمزيد من التحقيق. في الواقع ، أبلغت العديد من الدراسات عن نماذج ماوس mLN بطرق مختلفة14،21،22. على سبيل المثال ، تم إجراء ورم خبيث عفوي في LNs الإبطية من خلال زرع خلايا سرطان الثدي 4T1 في وسادة الدهون الثديية22. في دراسة أخرى ، قام Reticker-Flynn et al. بتوليد خطوط خلايا سرطان الجلد مع ارتفاع معدل الانتشار من الورم الأولي تحت الجلد إلى LNs من خلال التلقيح التسلسلي للخلايا السرطانية المزروعة من أنسجة mLN المنفصلة (تسع جولات) 14. تم إعداد نموذج آخر شائع الاستخدام عن طريق حقن الخلايا السرطانية في وسادة القدم وسيتم تشكيل المواضع النقيلي في LN22 المأبضي. والجدير بالذكر أنه من الصعب تقييم النقاط الزمنية الدقيقة للتدخل لأن ورم خبيث LN في هذه النماذج ليس دائما مخلصا.
في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج نقيلي LN للفأر من خلال الحقن داخل العقد لخلايا B16F10-GP23,24 ، الناتجة عن الإدخال بوساطة CRISPR / Cas9 لتسلسل جين البروتين السكري لفيروس LCMV (GP) في جينوم خط خلية B16F109. بعد ذلك ، تم نقل هذه الفئران بخلايا P14 التي تؤوي مستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيا (TCRs) على وجه التحديد على H-2Db GP33-41 25,26 ويمكن التحقيق في الديناميات النظامية والمحلية لخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN. يوفر تصميمنا التجريبي نموذجا مفيدا لدراسة الاستجابات المناعية ، وخاصة الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN والذي يستبعد اضطراب خلايا CD8 + T المتارة. ستؤثر هذه النتائج على خيارات العلاج السريري حول إزالة mLN أو الاحتفاظ به وإلقاء ضوء جديد على التلاعب ب mLN لتحقيق أقصى قدر من الفوائد العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت الفئران C57BL / 6J (المشار إليها بالفئران B6) والفئران المعدلة وراثيا P14 الساذجة 9,27 المستخدمة من 6 إلى 10 أسابيع من العمر تزن 18-22 جم. تم تضمين كل من الذكور والإناث دون عشوائية أو تعمية. أجريت جميع الدراسات على وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة تشينغداو الزراعية.
1. تحضير الوسط والكواشف
- قم بإعداد وسط زراعة خلايا سرطان الجلد B16F10-GP ، المسمى D10 (وسط DMEM الكامل) عن طريق إضافة DMEM ، مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 1٪ L-glutamine مع 100 وحدة / مل بوروميسين إضافية. الحفاظ على D10 معقم وتخزينها لمدة تصل إلى أسبوعين في 2-4 درجة مئوية.
- تحضير وسط R2 (لإنهاء تحلل خلايا الدم الحمراء) عن طريق إضافة RPMI-1640 مع 2٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 1٪ L-glutamine.
- قم بإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) عن طريق إضافة 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 2٪ FBS و 0.01٪ من أزيد الصوديوم. يمكن أن تؤدي إضافة أزيد الصوديوم إلى إطالة وقت تخزين المخزن المؤقت FACS ، والذي يمكن تخزينه لعدة أشهر عند 2-4 درجة مئوية.
- قم بإعداد محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBL) عن طريق إضافة 155 mM NH4Cl و 10 mM KHCO3 و 0.1 mM من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA) في الماء المقطر المزدوج وضبط درجة الحموضة إلى 7.3. قم بتخزين المخزن المؤقت RBL في درجة حرارة الغرفة (RT) ويظل مستقرا لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- تحضير مخدر ، 2،2،2-ثلاثي برومو إيثانول ، كما هو موضح أدناه.
- قم بوزن الكمية المناسبة من بلورة 2،2،2-ثلاثي برومو إيثانول في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل ملفوف بورق الألمنيوم. أضف كمية مناسبة من 2-ميثيل-2-بيوتانول إلى البلورة لتحضير محلول المرق بتركيز 500 مجم / مل.
- قم بتدويره لخلط الأنبوب وتدفئته في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تذوب البلورة. تأكد من إذابة جميع البلورات.
- خلط الحل جيدا. قم بتصفية محلول المخزون بفلتر 0.22 ميكرومتر في حاوية معقمة. قم بتخزين محلول المخزون مجمدا ، محميا من الضوء ، عند -20 درجة مئوية أو مخففا باستخدام PBS في محلول عملي بتركيز 12.5 مجم / مل ومخزن عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: من الأفضل استخدام التركيز الموصوف لأن التركيزات العالية من السائل مزعجة.
2. إعداد تعليق خلية B16F10-GP
- قم بإذابة وزراعة قارورة من 1 × 106 خلايا B16F10-GP مع 5 مل من D10 في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. خلايا الاستزراع الفرعي عندما وصلت إلى كثافة 80٪ إلى 90٪ كما هو موضح أدناه.
- تخلص من وسط الاستزراع الأصلي عن طريق الشفط بمسدس ماصة واغسل الخلايا 2x باستخدام PBS. عند تنظيف الخلايا الملتصقة باستخدام برنامج تلفزيوني في طبق زراعة الخلايا ، انقل برنامج تلفزيوني إلى الجدار الجانبي أو أسقطه في الطبق.
- بعد طموح برنامج تلفزيوني ، أضف 0.5-1 مل من محلول التربسين EDTA بنسبة 0.25٪ إلى طبق أو قارورة زراعة الخلايا. رج العبوة برفق لتغطية سطح الخلية بالكامل. ضع طبق زراعة الخلايا أو القارورة في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تقريبا أو في RT حتى يتم تقريب الخلايا وفصلها. مراقبة تقشير الخلايا بمساعدة المجهر المقلوب.
- أضف حجما متساويا من D10 المركب حديثا لإنهاء هضم التربسين. قم بتطهير السطح السفلي لقارورة زراعة الخلايا باستخدام مسدس ماصة لضمان فصل جميع الخلايا.
- انقل تعليق الخلية B16F10-GP إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 163 × جم لمدة 4 دقائق في RT.
- نضح طاف وتجاهل. أعد تعليق الخلايا في 1-2 مل من D10 لهطول الأمطار. انقل معلق الخلايا B16F10-GP إلى طبق أو قارورة جديدة لزراعة الخلايا تحتوي على 8-10 مل من D10 ثم احتضانها في حاضنة الخلايا عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2.
- في يوم زرع الورم ، اجمع خلايا B16F10-GP بكثافة تقارب 90٪ كما هو موضح في الخطوات 2.1.1 إلى 2.1.4. بعد الطرد المركزي ، نضح طاف وتجاهل. أعد تعليق الخلية المترسبة في 1 مل من PBS.
- عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم الأزرق تريبان 0.4٪. أضف برنامج تلفزيوني لتخفيف الخلية إلى 5 × 105 خلايا لكل 100 ميكرولتر. ضع الخلايا على الثلج حتى الاستخدام.
3. التلقيح خارج الرحم لخلايا B16F10-GP في المنطقة الأربية الثنائية للفئران
- نضح 100 ميكرولتر من معلق خلية B16F10-GP المحضر باستخدام حقنة سعة 1 مل. حرك جدار الأنبوب لتحريك الفقاعات إلى الأعلى وادفع المكبس لتحريك الفقاعة العلوية للخارج.
- امسك الماوس في وضع ضعيف ، وفضح بطنه. اضغط على الطرف الخلفي الأيمن للماوس في وضع ضعيف بإصبع بحيث يكون الجلد في المنطقة الأربية اليمنى مكشوفا بالكامل (نفس الشيء مع المنطقة الأربية اليسرى).
- إزالة الفراء على البطن مع كريم مزيل الشعر ، ثم تنظيف منطقة البطن الثنائية مع القطن الذي يحتوي على 75 ٪ من الإيثانول.
- قبل إدخال الإبرة ، تأكد من شد الجلد في المنطقة الأربية. أدخل الإبرة بزاوية 45 درجة في الفضاء تحت الجلد للمنطقة الأربية من أعلى الفخذ. تأكد من أن الإبرة مشطوفة لأعلى وعمق الإبرة إلى 0.5-1 سم.
- ضع شفطا لطيفا قبل الحقن ، إذا لم يكن هناك دم ، فقم بحقن الخلايا المحقونة ببطء في الأنسجة تحت الجلد. في الوقت نفسه ، لاحظ بلعة صغيرة (تشكيل جيب السوائل) في المنطقة تحت الجلد.
- بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة ، وضعها في صندوق الأدوات الحادة ، وأعد الماوس إلى قفصه.
4. النقل بالتبني للخلايا التائية P14 إلى الفئران الحاملة للورم
- إجراء النقل بالتبني في الفئران الحاملة للورم بعد 6-8 أيام من زرع الورم ، عندما تكون الأورام واضحة (قطرها حوالي 3-5 مم). حقن داخل الصفاق 4 ملغ سيكلوفوسفاميد في اليوم السابق لنقل28،29،30.
ملاحظة: الهدف من حقن CTX هو خلق مساحة في المقصورة اللمفاوية للخلايا التائية المنقولة بالتبني عن طريق القضاء بشكل عابر على الخلايا الليمفاوية المتكاثرة. - عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال و LNs للفئران المعدلة وراثيا P14 الساذجة كما هو موضح أدناه31,32 (6-10 أسابيع من العمر ، من نفس جنس الفئران الحاملة للورم لتجنب مشاكل الرفض).
ملاحظة: نفذ الإجراءات التالية في خزانة السلامة البيولوجية لضمان ظروف معقمة تماما.- قم بإعداد طبقين بحجم 6 سم وأضف 3 مل من وسط R2 إلى أحد الأطباق و 3 مل من محلول RBL إلى الطبق الآخر. ضع مرشح خلية 70 ميكرومتر في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن RBL المؤقت.
- القتل الرحيم P14 الفئران في حاويات محكمة الإغلاق تحتوي على إيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم. اضبط عدد الفئران P14 وفقا لعدد الفئران المتلقية.
- حصاد الغدد الليمفاوية الطحال والأربية والإبطية من الفئران القتل الرحيم ونقلها إلى أطباق 6 سم تحتوي على 4 مل من وسط R2 ووضعها على الجليد.
- ضع الطحال في مصفاة مبللة ب 3 مل من محلول RBL ، وطحن الطحال بالمضرب داخل حقنة 1 مل. احتضان الخلايا في RT لمدة 1-2 دقيقة ، ثم إنهاء التفاعل مع 3 مل من وسط R2 البارد.
- قم بطحن LNs باستخدام المضرب داخل المحقنة سعة 1 مل حتى يبقى النسيج الضام فقط في المصفاة باستخدام مرشح خلية 70 ميكرومتر. شطف المرشح مع وسيط R2 الباردة ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد 15 مل. أجهزة الطرد المركزي العينات في 500 × غرام لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 3 مل من برنامج تلفزيوني. استخدم مرشح خلية 70 ميكرومتر لإزالة المواد الندفية من تعليق الخلية.
- جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا ب 3 مل من PBS وضع الأنبوب على الثلج. خذ عينة صغيرة ، واخلطها مع التريبان الأزرق ، وعد الخلايا باستخدام لوحة عد خلايا الدم.
- أوجد النسبة المئوية لخلايا P14 (حية / ميتة CD45.1 + CD8 + Vα2 +) عن طريق قياس التدفق الخلوي. تأكد من أن الخلايا المانحة المنقولة تظهر علامة متجانسة مميزة مع الفئران المتلقية (الفئران B6 الحاملة للورم هي CD45.2+). قم بإجراء تلطيخ قبل النقل للتحقق من النمط الظاهري الصحيح للخلايا المنقولة.
- أضف 5 × 104- 1 × 105 خلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول المجمعة (FACS). جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية ، ونفض الغبار عن قاع الأنبوب لتفريق الخلايا ، وضع الأنبوب على الثلج.
- تحضير خليط الأجسام المضادة المترافق التالي 9,32 المخفف في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS: anti-CD8 ، 1: 200 ؛ مكافحة TCR Vα2 ، 1: 100 ؛ مكافحة CD45.1 ، 1: 200 ؛ بقعة حية / ميتة ، 1: 400. (جدول المواد).
- أجهزة الطرد المركزي خليط الأجسام المضادة عند 15000 × جم لمدة 3 دقائق لتجميع الجسيمات. ضع الخليط على الثلج واحفظه من الضوء عن طريق لفه بورق الألمنيوم. خذ فقط طاف لتجنب طموح الجزيئات.
- أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة واخلطها جيدا عن طريق تحريك جدار الأنبوب. بعد التفافها بورق القصدير ، احتضن الأنبوب لمدة 30 دقيقة على الثلج.
- اغسل الخلايا 2x باستخدام المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. أعد تعليق الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب تدفق.
- قم بتشغيل أنبوب التدفق بخلايا ملطخة على مقياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للخلايا الحية / الميتة CD45.1 + CD8 + Vα2 + .
ملاحظة: بشكل عام ، أكثر من 90٪ من خلايا CD8 + T من الفئران المعدلة وراثيا P14 تؤوي Vα2 + TCRs ، وهي خاصة ب H-2Db GP33-41 من LCMV (فيروس التهاب المشيمة اللمفاوي).
- احسب العدد المطلق للخلايا الحية / الميتة CD45.1 + CD8 + Vα2 + بضرب النسبة المئوية وعدد الخلايا الحية التي تم الحصول عليها في الخطوتين 4.2 و 4.3.
- نضح 200 ميكرولتر من خلية P14 (5 × 105 خلايا) معلقة مع حقنة الأنسولين 100 U وإزالة الفقاعات. لم يؤثر العدد الأولي لخلايا P14 الساذجة المنقولة (5 × 103 - 5 × 105) على النمط الظاهري للخلاياالمنقولة 9.
- ضع الفئران في قفص ودفئها باستخدام مصباح الأشعة تحت الحمراء لمدة 5-10 دقائق لتوسيع الوريد الذيل. ثبت في مكانه باستخدام مثبت فأر بحجم مناسب ، وقم بتصويب الذيل ، وامسحه بكرة قطنية تحتوي على 75٪ من الإيثانول لجعل الأوردة مرئية.
- أدخل الإبرة بالتوازي مع الوريد الذيل واسحب المكبس برفق. إذا كان هناك دم يتدفق إلى المحقنة ، ادفع تعليق الخلية ببطء إلى الوريد.
ملاحظة: إذا كانت هناك مقاومة أو تورم في الذيل أثناء الحقن ، فيجب تعديل موضع الحقن. يجب أن يبدأ موقع الحقن في النهاية البعيدة. - بعد اكتمال الحقن ، اسحب الإبرة بسرعة واضغط على موقع الحقن برفق باستخدام كرة قطنية. أعد الماوس إلى قفص نظيف جديد وراقبه عن كثب لعدة دقائق بحثا عن أي آثار ضارة.
5. استئصال الورم الرئيسي
ملاحظة: تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الاستخدام. تعقيم منطقة التشغيل داخل خزانة السلامة الحيوية بنسبة 75٪ من الإيثانول ، تليها الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل. ارتد العباءات والقبعات والأقنعة والقفازات المعقمة النظيفة أثناء الجراحة.
- عندما يكون الورم واضحا (قطره حوالي 5 مم) ، قم باستئصال الورم الرئيسي.
- تخدير الفئران بحقن الكيتامين داخل الصفاق (75 ملغم / كغم). قرصة وسادة القدم لتقييم درجة التخدير ، إذا لم يكن هناك رد فعل للألم ، فهذا يشير إلى التوقيت المناسب للجراحة. إذا تم سحب الأطراف الخلفية ، قدم جرعة أخرى من 10-30 ميكرولتر.
ملاحظة: بدلا من ذلك، ميديتوميدين داخل الصفاق (1 ملغ/كغ من وزن الجسم; Domitor) ينصح بتخدير الفئران. - ضع مرهم التجفيف الوقائي على عيون الفأر. إزالة الفراء على البطن مع كريم مزيل الشعر لفضح المجال الجراحي بالكامل.
- ضع الماوس في خزانة السلامة الحيوية وضعه على لوح تشريحي مغطى بورق ماص نظيف في وضع ضعيف بحيث يكون المحور الطولي للفأر موازيا للمجرب.
ملاحظة: للحفاظ على بيئة معقمة صارمة ، يجب تنفيذ الإجراءات التالية في خزانة السلامة البيولوجية. - تطهير بطن الفئران مع كرة القطن غارقة في البوفيدون اليود. شق الجلد بالقرب من الموقع الحامل للورم بمشرط معقم أو مقص عيون. أدخل طرف مقص مغلق في الشق لكشف الورم بوضوح. عند شق الجلد ، تأكد من عدم إتلاف الغدد الليمفاوية الأربية.
- أثناء إزالة الورم ، حافظ على الكبسولة سليمة قدر الإمكان. بعناية وبلطف إزالة النسيج الضام المجاور للورم مع مقص معقمة. إزالة الورم في الموقع تماما ، وإلا فقد يتكرر.
6. الحقن داخل العقد لخلايا B16F10-GP في العقدة الليمفاوية الأربية
ملاحظة: بعد إزالة الورم الثنائي ، تم حقن خلايا B16F10-GP في العقدة الليمفاوية الأربية أحادية الجانب وتم حقن PBS في الجانب الآخر.
- نضح 20 ميكرولتر (5 × 104 خلايا) من معلق الخلايا B16F10-GP مع حقنة الأنسولين 100 U ، وإزالة الفقاعات ثم حقنها في عقدة ليمفاوية إربية واحدة. حقن حجم متساو من PBS في العقدة الليمفاوية الأربية على الجانب الآخر.
- أثناء الحقن ، أدخل الإبرة من الطرف البعيد للعقدة الليمفاوية ، ثم أدخل الإبرة ببطء في مركز العقدة الليمفاوية. في هذا الوقت ، إذا تم حقن السائل بدقة في العقدة الليمفاوية ، يمكن رؤية العقدة الليمفاوية تنتفخ بشكل كبير.
ملاحظة: عند إدخال الإبرة من الطرف البعيد للعقدة الليمفاوية ، تأكد من عدم ثقب العقدة.
- أثناء الحقن ، أدخل الإبرة من الطرف البعيد للعقدة الليمفاوية ، ثم أدخل الإبرة ببطء في مركز العقدة الليمفاوية. في هذا الوقت ، إذا تم حقن السائل بدقة في العقدة الليمفاوية ، يمكن رؤية العقدة الليمفاوية تنتفخ بشكل كبير.
- خياطة شق مع 2-3 غرز باستخدام خياطة 3-0. تطهير الجلد المحيط بالجرح بالقطن المشرب بيود البوفيدون. احرص على تجاوز الغدد الليمفاوية أثناء الخياطة.
- ضع الماوس في قفص نظيف وحافظ على الدفء باستخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء في وضع الاستلقاء الجانبي. راقب باستمرار حتى يتم استعادة الوعي. تأكد من عدم إعادة الفئران التي خضعت لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى تتعافى تماما.
- يجب إعطاء البوبرينورفين كل 4-6 ساعات لمدة 3 أيام متتالية بعد العملية لتخفيف آلام ما بعد الجراحة (بجرعة 0.1-0.5 مجم / كجم ، SQ أو IP). راقب مناطق التغذية والشرب والحركة والنشاط للفئران. عادة ، تتعافى الفئران من الصدمة الجراحية في غضون 3 أيام.
ملاحظة: إذا كانت الفئران غير قادرة على استئناف التغذية والأنشطة الطبيعية وتظهر أي علامات للعدوى ، فاستشر الطبيب البيطري للتدخل أو القتل الرحيم. - التضحية بالفئران في نقاط زمنية مختلفة: اليوم 8 واليوم 18 بعد الحقن داخل العقد للخلايا السرطانية. استعادة الخلايا المانحة المنشطة باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الرسم التخطيطي لهذا التصميم التجريبي في الشكل 1 أ. تم زرع ما مجموعه 5 × 105 خلايا B16F10-GP في 100 ميكرولتر من PBS تحت الجلد (s.c.) في المنطقة الأربية الثنائية للفئران CD45.2 C57BL / 6J. بعد 7 أيام ، تم حقن هذه الفئران الحاملة للورم داخل الصفاق (i.p.) ب 4 ملغ CTX ، تليها النقل بالتبني لخلايا 5 × 105 CD45.1 + P14 من خلال حقن الذيل في الوريد (IV). عندما نمت الأورام إلى قطر 3-5 مم تقريبا (حوالي 7 أيام بعد نقل خلايا P14) ، تم استئصال الأورام الأولية ، وتم حقن 5 × 104 خلايا B16F10-GP في 20 ميكرولتر من PBS مباشرة في العقدة الليمفاوية الأربية أحادية الجانب. تم حقن العقدة الليمفاوية الأربية على الجانب الآخر بأحجام متساوية من PBS. يوضح الشكل 1B تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E ، 100x) التمثيلي للعقدة الليمفاوية غير النقيلية (nLN) والعقدة الليمفاوية النقيلي (mLN) في نقاط زمنية محددة. كان هيكل nLN سليما. في المرحلة المبكرة من ورم خبيث LN (D8) ، كان mLN مشغولا جزئيا بالخلايا السرطانية (السهم الأسود) ، ولا تزال هناك بعض المناطق المتبقية بها الخلايا الليمفاوية التي لم تغزوها الخلايا السرطانية (السهم الأحمر). بينما في المرحلة المتأخرة من ورم خبيث LN (D18) ، تمتلئ mLN بالخلايا السرطانية المصحوبة بتكوين الأوعية الدموية للورم والخلايا الليمفاوية الصغيرة. أنتجت خلايا P14 المنشطة المستردة في TdLN مستوى عال من IFN-γ بعد تحفيز الببتيد GP33-41 9,31. هنا ، تم تحليل النسب المئوية لخلايا P14 المنشطة من خلال قياس التدفق الخلوي في نقاط زمنية مختلفة وتظهر استراتيجية البوابة في الشكل 2. تواتر الخلايا التائية CD8 + T الخاصة بالمستضد في الدم المحيطي في المرحلة المبكرة (D8) والمرحلة المتأخرة (D18) هو 2.81٪ و 1.48٪ على التوالي (الشكل 3A). تم الإبلاغ عن أن خلايا CD8 + T الخاصة بالورم موجودة بشكل صارم في dLN أثناء تكوين الورم وخلايا LN غير المستردة من الخلايا المانحةالمحدودة 33. كانت النسبة المئوية لخلايا P14 الخاصة بالمستضد في nLN مستقرة أثناء ورم خبيث LN. ومن المثير للاهتمام ، أن خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد في mLN تم تعزيزها بشكل عابر في المرحلة المبكرة ، كما يتضح من التردد العالي لخلايا P14 مقارنة ب nLN ، بينما انخفض بشكل حاد في المرحلة المتأخرة (الشكل 3B).
الشكل 1: رسم تخطيطي للتصميم التجريبي. (أ) يتم زرع الفئران C57BL / 6J (CD45.2 +) مع 5 × 105 B16F10-GP الخلايا السرطانية في المنطقة الأربية الثنائية. بعد 7 أيام ، يتم حقن هذه الفئران داخل الصفاق ب 4 ملغ CTX ، ويتبعها النقل بالتبني لخلايا P14 مختلفة ذات علامة خلقية (CD45.1+) في اليوم التالي. عندما تنمو الأورام إلى قطر 3-5 مم تقريبا (حوالي 7 أيام بعد نقل خلايا P14) ، يتم استئصال الأورام الأولية ، ثم يتم حقن 5 × 104 خلايا B16F10-GP في 20 ميكرولتر من PBS مباشرة في العقدة الليمفاوية الأربية من جانب واحد ، ويتم حقن العقدة الليمفاوية الأربية على الجانب الآخر بكميات متساوية من PBS. (ب) تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E,100x) التمثيلي لل LNs. الاختصارات: s.c. = تحت الجلد; CTX = سيكلوفوسفاميد. i.v. = عن طريق الوريد. ساك = تضحية. nLN = LN غير النقيلي ؛ mLN = LN النقيلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية البوابات لتحليل قياس التدفق الخلوي. تستخدم استراتيجية البوابات لتحديد الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد المنشط المشتق من المتبرع. الاختصارات: L / D = حي / ميت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ديناميات الخلايا التائية CD8+ الخاصة بمولد الضد أثناء ورم خبيث LN. نسبة الخلايا التائية CD8+ الخاصة بمولد الضد في الدم المحيطي ( أ) و( ب) nLN وmLN في نقاط زمنية مختلفة. الاختصارات: nLN = LN غير النقيلي ؛ mLN = LN النقيلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء تكوين الورم ، تبتلع الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) مستضدات الورم وتهاجر إلى TdLN حيث تقوم بتجهيز خلايا CD8 + T. بعد التحضير والتنشيط ، تترك خلايا CD8 + T TdLN وتتسلل إلى الورم لقتل الخلايا السرطانية10. من خلال استئصال TdLN وإدارة FTY720 التي تمنع خروج الخلايا المناعية من الأعضاء اللمفاوية ، أظهرت العديد من الدراسات الدور المحوري ل TdLN في ضمان فعالية علاج نقطة التفتيش PD-1 / PD-L134,35. تمشيا مع هذا ، وجدنا مؤخرا أن خلايا الذاكرة CD8 + T (TTSM) الخاصة بالورم موجودة في الغالب في TdLN ، وتعمل خلايا TdLN-TTSM هذه كمستجيبين حقيقيين ل ICB9. لسوء الحظ ، غالبا ما تنتشر عدة أنواع من الخلايا السرطانية إلى TdLNs من مواقع الورم الأولية ، مما يؤدي إلى إعادة التأكيد الهيكلي واختلال الخلايا المناعية في TdLNs. تم بالفعل وصف الكمية والجودة الضعيفة للخلايا التائية CD8 + في mLNs20,36. ومع ذلك ، لم يتم توضيح التغييرات الديناميكية للخلايا التائية CD8 + T ، وخاصة الخلايا التائية CD8 + الخاصة بمستضد الورم خلال سلسلة LN النقيلي.
هنا ، قمنا بتطوير نموذج فأر مناسب لمراقبة ديناميكيات الخلايا التائية CD8 + T الجهازية والمحلية الخاصة بالمستضد أثناء عملية ورم خبيث LN. تم زرع خلايا سرطان الجلد B16F10-GP تحت الجلد في المنطقة الأربية الثنائية ، تليها النقل بالتبني مع خلايا P14 التي يمكن تنشيطها على وجه التحديد بواسطة الببتيد المشتق من GPGP 33-41. في اليوم 7 بعد نقل الخلايا عندما تم تنشيط خلايا P14 في LNs الأربية بالكامل ، وتم استئصال الأورام الأولية في كلا الجانبين وتم حقن خلايا B16F10-GP مباشرة في LN الأربية من جانب واحد ، تم إجراء عملية وهمية على الجانب الآخر من خلال الحقن بأحجام متساوية من PBS. يتيح هذا التصميم المبتكر مقارنة خلايا P14 في mLN و LN غير النقيلي (nLN) داخل نفس الفئران. في الوقت نفسه ، تم اكتشاف خلايا P14 في الدم المحيطي داخل نفس الفئران في نقاط زمنية مختلفة أثناء ورم خبيث LN عن طريق نزيف الوريد المداري. بصرف النظر عن ترددات خلايا P14 في الدم المحيطي و TdLNs في مراحل مختلفة أثناء ورم خبيث LN ، يمكن فحص الخصائص النسخية واللاجينية لهذه الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد باستخدام تقنيات أخرى.
تجدر الإشارة إلى أنه يجب تنفيذ عدة خطوات بحذر. أولا ، يجب استئصال الأورام الأولية تماما ، حيث ستنمو الخلايا السرطانية المتبقية بسرعة. ثانيا ، يجب إجراء العملية بلطف ، حيث تحتوي أنسجة الورم على أوعية دموية جديدة وفيرة والتي عادة ما تنكسر حتما أثناء استئصال الورم الأولي وتؤدي إلى موت الفئران الجراحية بسبب نزيف حاد. لذلك ، فإن توقيت استئصال الورم الأولي مهم للغاية. بشكل عام ، من الآمن نسبيا إزالته عندما ينمو الورم إلى حجم حوالي 5 × 5 مم ، ويجب حقن الخلايا السرطانية بدقة في LN بدلا من الأنسجة السفلية أو المجاورة. علاوة على ذلك ، يجب التحكم في حجم معلقات الخلايا السرطانية إلى أقل من 20 ميكرولتر ، وإلا فإن الانسكاب سيشكل ورما جديدا خارج LN. أخيرا ، يتمثل أحد قيود هذا البروتوكول في أن العملية مؤلمة ، وقد تتعرض الفئران للعدوى أثناء عملية الشفاء ، مما قد يؤثر على خصائص خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد. لذلك ، من المهم للغاية الحفاظ على التعقيم الصارم أثناء الجراحة ويجب إجراء حقن PBS الذي يتم تشغيله بشكل زائف لاستبعاد تأثير الضرر المادي الناجم عن الحقن على خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد.
بشكل عام ، نقدم نموذجا مناسبا للتحقق من الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN ويمكن أيضا توضيح التفاعلات بين الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد والخلايا المناعية الأخرى أو خلايا السدى أثناء ورم خبيث LN. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تمديده بسهولة إلى العديد من نماذج الأورام الأخرى. بشكل جماعي ، يقدم هذا البروتوكول نموذجا إنجابيا مفيدا لدراسة مناعة السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين في الصين (رقم 82122028 إلى LX) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82173094 إلى LX) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغ تشينغ (رقم 2023NSCQ-BHX0087 إلى SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
