Summary
Представленный здесь дизайн эксперимента представляет собой полезную репродуктивную модель для изучения антиген-специфических CD8+ Т-клеток при метастазировании в лимфатические узлы (ВН), которая исключает возмущение CD8+ Т-клеток.
Abstract
CD8+ Т-клетки опухолевого антигена из дренирующих лимфатических узлов приобретают все большее значение в формировании противоопухолевого иммунного ответа в процессе онкогенеза. Однако во многих случаях раковые клетки образуют метастатические локусы в лимфатических узлах перед дальнейшим метастазированием в отдаленные органы. В какой степени метастазы ЛН влияли на локальный и систематический ответ CD8+ Т-клеток, остается неясным. С этой целью мы создали мышиную модель метастазирования LN в сочетании с клеточной линией меланомы B16F10-GP, экспрессирующей суррогатный неоантиген, полученный из вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), гликопротеина (GP) и P14 трансгенных мышей, содержащих рецепторы Т-клеток (TCR), специфичные к пептиду GP33-41 , полученному из GP, представленному молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I H-2Db. Этот протокол позволяет изучать антиген-специфический ответ CD8+ Т-клеток при метастазировании ВН. В рамках этого протокола мышам C57BL/6J подкожно имплантировали клетки B16F10-GP с последующим адоптивным переносом наивными клетками P14. Когда подкожная опухоль достигала примерно 5 мм в диаметре, первичную опухоль иссекали, а клетки B16F10-GP вводили непосредственно в опухоль дренирующий лимфатический узел (TdLN). Затем контролировали динамику CD8+ Т-клеток в процессе метастазирования ВН. В совокупности эта модель обеспечила подход к точному исследованию антиген-специфического иммунного ответа CD8+ Т-клеток во время метастазирования ВН.
Introduction
Иммунотерапия рака, особенно блокада контрольных точек иммунного ответа (ICB), произвела революциюв терапии рака1. ICB блокирует коингибирующие иммунорецепторы (такие как PD-1, Tim-3, LAG-3 и TIGIT), которые высоко экспрессируются в истощенных CD8+ Т-клетках в опухолевом микроокружении (TME), что приводит к оживлению истощенных CD8+ Т-клеток2. Учитывая гетерогенность истощенных CD8+ Т-клеток, накопление доказательств показало, что опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки, полученные с периферии, включая дренирующий лимфатический узел (dLN), но не в TME, опосредуют эффективность ICB 3,4,5,6,7,8. Недавно было подтверждено, что полученные из TdLN TCF-1+TOX - опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки памяти (TdLN-TTSM) являются подлинными ответителями на ICB, которые воплощают в себе несколько функциональных свойств обычных Т-клеток памяти и могут в дальнейшем расширяться и дифференцироваться в истощенные клетки потомства при лечении ICB9. В целом, эти результаты подтвердили важность ЛН в формировании противоопухолевого иммунитета.
Лимфатические узлы функционируют как важнейшее место в содействии праймингу и активации опухолеспецифичных CD8+ Т-клеток, обеспечивая структурную основу, а также биологические сигналы10. Некоторые типы раковых клеток часто засеивают сторожевые лимфатические узлы (SLN, первый LN, дренирующий первичную опухоль) перед систематической диссеминацией11. Наличие метастазов SLN связано с плохим исходом при раке человека, и доклинические модели показали, что опухолевые клетки в TdLN могут распространяться в отдаленные органы как через лимфатические сосуды, так и через кровеносные сосуды узла 12,13,14,15. Биопсия SLN в настоящее время представляет собой стандартную процедуру для принятия последующих решений о лечении многих типов солидных опухолей, что позволяет избежать ненужной резекции непораженного LN16,17. Даже для пациентов с ВН остается спорным вопрос о том, нужна ли хирургическая резекция, и если да, то когда, поскольку несколько исследований показали, что удаление регионарной ВН не продемонстрировало улучшения общей выживаемости по сравнению с теми, кто получал лучевую или системную терапию без регионарной резекции ВН18,19. Одна из интерпретаций заключается в том, что метастатическая ВН (мЛН) с микроскопическим заболеванием может сохранять некоторую способность обучать иммунные клетки и обеспечивать некоторые терапевтические преимущества. Таким образом, критически важно выяснить, как метастазы ЛН влияют на противоопухолевый иммунный ответ, особенно на свойства и функции TdLN-TTSM.
До сих пор как доклинические, так и клинические данные выявили некоторые структурные и клеточные изменения в mLN20. Однако динамические изменения опухолеспецифичных CD8+ Т-клеток при метастазировании ЛН не очерчены. Поэтому для дальнейшего изучения необходима разработка убедительной модели метастазирования ВН. Действительно, в нескольких исследованиях сообщалось о моделях mLN на мышах различными способами 14,21,22. Например, спонтанное метастазирование в подмышечных ЛУ проводили путем имплантации клеток рака молочной железы 4Т1 в жировую подушкумолочной железы 22. В другом исследовании Reticker-Flynn et al. создали клеточные линии меланомы с высокой частотой распространения от подкожной первичной опухоли к ВН путем последовательной инокуляции опухолевых клеток, культивируемых из диссоциированных тканей mLN (девять раундов)14. Другая широко используемая модель была получена путем инъекции опухолевых клеток в подушечку стопы, и метастатические локусы образовывались в подколенной LN22. Примечательно, что трудно оценить точные сроки вмешательства, поскольку метастазы ВН в этих моделях не всегда точны.
В настоящем исследовании мышиная метастатическая модель LN была создана путем интранодальной инъекции клеток B16F10-GP23,24, полученных путем CRISPR/Cas9-опосредованной вставки последовательности гена гликопротеина (GP) вируса LCMV в геном клеточной линии9 B16F10. Затем этим мышам были пересажены клетки P14, которые содержат трансгенные Т-клеточные рецепторы (TCR), специфически распознающие эпитоп H-2Db GP33-41 25,26, и можно было исследовать системную и локальную динамику антиген-специфических CD8+ Т-клеток при метастазировании ЛН. Наш экспериментальный дизайн представляет собой полезную модель для изучения иммунных реакций, особенно антиген-специфических CD8+ Т-клеток во время метастазирования ЛН, что исключает возмущение CD8+ Т-клеток. Эти результаты повлияют на варианты клинического лечения, связанные с удалением или сохранением mLN, и прольют новый свет на манипуляции с mLN для достижения максимального терапевтического эффекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши C57BL/6J (относящиеся к мышам B6) и наивные трансгенные мышиP14 9,27 были в возрасте 6-10 недель с массой тела 18-22 г. Как мужчины, так и женщины были включены в исследование без рандомизации или ослепления. Все исследования на животных проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Циндаоского сельскохозяйственного университета.
1. Приготовление среды и реагентов
- Приготовьте питательную среду для клеток меланомы B16F10-GP, названную D10 (полная среда DMEM), добавив DMEM, 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 1% пенициллин/стрептомицин, 1% L-глютамин с дополнительными 100 ЕД/мл пуромицина. Поддерживайте стерильность D10 и храните до 2 недель при температуре 2-4 °C.
- Приготовьте среду R2 (для прекращения лизиса эритроцитов), добавив RPMI-1640 с 2% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% L-глютамина.
- Приготовьте буфер для флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS), добавив 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) с 2% FBS и 0,01% азида натрия. Добавление азида натрия позволяет продлить срок хранения буфера FACS, который может храниться месяцами при температуре 2-4°С.
- Приготовьте буфер для лизиса эритроцитов (RBL), добавив 155 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3 и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в двойную дистиллированную воду и отрегулируйте ее pH до 7,3. Храните RBL-буфер при комнатной температуре (RT), и он остается стабильным до 3 месяцев.
- Приготовьте анестетик, 2,2,2-трибромэтанол, как описано ниже.
- Отвесьте необходимое количество кристаллов 2,2,2-трибромэтанола в стерильной конической пробирке объемом 50 мл, обернутой алюминиевой фольгой. Добавьте в кристалл необходимое количество 2-метил-2-бутанола для приготовления исходного раствора с концентрацией 500 мг/мл.
- Перемешайте и нагрейте пробирку на водяной бане с температурой 37 °C, пока кристалл не растворится. Убедитесь, что все кристаллы растворились.
- Тщательно перемешайте раствор. Отфильтруйте исходный раствор фильтром 0,22 мкм в стерильный контейнер. Исходный раствор хранят замороженным, защищенным от света, при -20 °С или разбавляют ПБС в рабочий раствор в концентрации 12,5 мг/мл и хранят при 4 °С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать предписанную концентрацию, так как более высокие концентрации жидкости раздражают.
2. Приготовление клеточной суспензии B16F10-GP
- Разморозьте и культивируйте флакон 1 x 106 клеток B16F10-GP с 5 мл D10 в инкубаторе клеточных культур при 37 °C и 5% CO2. Субкультура клеток, когда они достигают плотности от 80% до 90%, как описано ниже.
- Исходную питательную среду отбраковывают путем аспирации с помощью пистолета-пипетки и промывают клетки 2 раза PBS. При очистке адгезивных клеток с помощью PBS в чашке для клеточных культур переместите PBS к боковой стенке или опустите его в чашку.
- После аспирации ПБС добавляют 0,5-1 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА в чашку или колбу для клеточных культур. Аккуратно встряхните, чтобы покрыть всю поверхность клетки. Поместите чашку или колбу для клеточных культур в инкубатор при температуре 37 °C примерно на 1 минуту или на RT до тех пор, пока клетки не округлятся и не разделятся. Наблюдайте за отшелушиванием клеток с помощью инвертированного микроскопа.
- Добавьте равный объем свежеприготовленного D10, чтобы прекратить переваривание трипсина. Продуйте нижнюю поверхность колбы с клеточными культурами с помощью пистолета для пипетирования, чтобы убедиться, что все клетки были разделены.
- Переложите суспензию клеток B16F10-GP в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 163 x g в течение 4 мин при RT.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и выбросьте. Ресуспендируйте клетки в 1-2 мл D10 для осаждения. Переносят клеточную суспензию B16F10-GP в новую чашку для клеточных культур или колбу, содержащую 8-10 мл D10, а затем инкубируют в клеточном инкубаторе при 37 °C при 5% CO2.
- В день имплантации опухоли соберите клетки B16F10-GP с плотностью примерно 90%, как описано в шагах 2.1.1 - 2.1.4. После центрифугирования аспирировать надосадочную жидкость и выбросить. Ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл PBS.
- Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью 0,4% гемоцитометра трипанового синего. Добавьте PBS, чтобы разбавить клетку до 5 x 105 клеток на 100 мкл. Поместите клетки на лед до использования.
3. Эктопический посев клеток B16F10-GP в двустороннюю паховую область мышей
- Аспирировать 100 мкл готовой клеточной суспензии B16F10-GP с помощью шприца объемом 1 мл. Щелкните по стенке трубки, чтобы переместить пузырьки наверх, и надавите на поршень, чтобы выдвинуть верхний пузырь.
- Держите мышь в положении лежа на спине, обнажив ее брюшко. Надавите пальцем на правую заднюю конечность мыши в положении лежа на спине так, чтобы кожа в правой паховой области была полностью обнажена (то же самое с левой паховой областью).
- Удалите шерсть на животе с помощью крема для депиляции, затем очистите двустороннюю область живота ватой, содержащей 75% этилового спирта.
- Перед введением иглы убедитесь, что кожа в паховой области подтянута. Введите иглу под углом 45° в подкожное пространство паховой области верхней части бедра. Убедитесь, что игла скошена вверх, а глубина иглы 0,5-1 см.
- Примените осторожное отсасывание перед инъекцией, если нет крови, введите медленно введенные клетки в подкожную клетчатку. При этом наблюдают небольшой болюс (образование жидкого кармана) в подкожной области.
- После инъекции извлеките иглу, поместите ее в коробку для острых предметов и верните мышь в клетку.
4. Адоптивный перенос Т-клеток P14 мышам-опухоленосителям
- Проводят адоптивный перенос у мышей-опухоленосителей через 6-8 дней после имплантации опухоли, когда опухоли пальпируются (примерно 3-5 мм в диаметре). Внутрибрюшинно вводят 4 мг циклофосфамида за сутки до переноса 28,29,30.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью инъекции CTX является создание пространства в лимфатическом компартменте для адоптивно перенесенных Т-клеток путем временного устранения пролиферирующих лимфоцитов. - Изолируйте лимфоциты из селезенки и ЛН наивных трансгенных мышей P14, как описано ниже31,32 (6-10 недель, того же пола, что и мыши-носители опухолей, чтобы избежать проблем с отторжением).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие процедуры в шкафу биобезопасности, чтобы обеспечить строго стерильные условия.- Приготовьте две чашки по 6 см и добавьте в одну из посуды 3 мл среды R2 и в другую чашку 3 мл буфера RBL. Поместите клеточный фильтр 70 мкм в чашку Петри, содержащую RBL-буфер.
- Усыпляют мышей P14 в герметичных контейнерах, содержащих изофлуран, с последующим вывихом шейки матки. Отрегулируйте количество мышей P14 в соответствии с количеством мышей-реципиентов.
- Соберите селезенку, паховые и подмышечные лимфатические узлы у усыпленных мышей и перенесите их в 6-сантиметровые чашки, содержащие 4 мл среды R2, и поместите их на лед.
- Поместите селезенку в ситечко, пропитанное 3 мл RBL-буфера, измельчите селезенку клюшкой внутри шприца объемом 1 мл. Инкубируют клетки при РТ в течение 1-2 мин, затем прекращают реакцию 3 мл холодной среды R2.
- Измельчите LN клюшкой внутри шприца объемом 1 мл до тех пор, пока в сетчатом фильтре с клеточным фильтром 70 мкм не останется только соединительная ткань. Промойте фильтр холодной средой R2 и перенесите суспензию ячейки в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют образцы при 500 x g в течение 6 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки с помощью 3 мл PBS. Используйте клеточный фильтр 70 мкм для удаления хлопьевидного материала из клеточной суспензии.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 500 x g в течение 6 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте клетки с 3 мл PBS и поместите пробирку на лед. Возьмите небольшой образец, смешайте с трипановым синим и подсчитайте клетки с помощью планшета для подсчета клеток крови.
- Определение процентного содержания клеток P14 (живых/мертвых CD45.1+CD8+Vα2+) методом проточной цитометрии. Убедитесь, что перенесенные донорские клетки демонстрируют отчетливый конгенный маркер с мышами-реципиентами (мыши с опухолью B6 имеют CD45,2+). Перед переносом проведите окрашивание, чтобы убедиться в правильности фенотипа перенесенных клеток.
- Добавьте 5 x 104- 1 x 105 клеток в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл буфера FACS. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 x g при 4 °C в течение 3 мин.
- Выбросьте надосадочную жидкость, щелкните дном пробирки, чтобы рассеять клетки, и поместите пробирку на лед.
- Готовят следующую смесь конъюгированных антител 9,32, разведенную в 100 мкл буфера FACS: анти-CD8, 1:200; анти-TCR Vα2, 1:100; анти-CD45.1, 1:200; Живое/мертвое пятно, 1:400. (Таблица материалов).
- Центрифугируйте смесь антител при концентрации 15 000 x g в течение 3 мин для агрегации частиц. Выложите смесь на лед и защитите ее от света, завернув в фольгу. Принимайте только надосадочную жидкость, чтобы избежать аспирации частиц.
- Ресуспендируйте клетки в 100 мкл смеси антител и тщательно перемешайте, щелкнув стенкой пробирки. Завернув в фольгу, выдержите пробирку в течение 30 минут на льду.
- Промойте клетки 2 раза буфером FACS. Центрифугируйте пробирку при 500 x g при 4 °C в течение 3 мин. Ресуспендируйте ячейки с помощью 200 мкл буфера FACS и перенесите суспензию клеток в проточную трубку.
- Проведите проточную трубку с окрашенными клетками на проточном цитометре, чтобы определить процентное соотношение живых/мертвых клеток CD45.1+CD8+Vα2+.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, более 90% CD8+ Т-клеток трансгенных мышей P14 содержали Vα2+TCR, которые специфичны для эпитопа H-2Db GP33-41 LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита).
- Рассчитайте абсолютное число живых/мертвых клеток CD45.1+CD8+Vα2+ , умножив его процентное соотношение на число живых клеток, полученное на шагах 4.2 и 4.3.
- Аспирировать 200 мкл суспензии клеток P14 (5 x 105 клеток) инсулиновым шприцем 100 ЕД и удалить пузырьки. Исходное количество перенесенных наивных клеток P14 (5 х 103 - 5 х 105) не влияло на фенотип перенесенных клеток9.
- Поместите мышей в клетку и согрейте инфракрасной лампой в течение 5-10 мин, чтобы расширить хвостовую вену. Закрепите на месте фиксатором мыши соответствующего размера, расправьте хвост и протрите его ватным тампоном, содержащим 75% этанола, чтобы сделать вены видимыми.
- Введите иглу параллельно хвостовой вене и аккуратно потяните поршень назад. Если в шприц течет кровь, медленно протолкните клеточную суспензию в вену.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время инъекции возникает сопротивление или отек хвоста, необходимо отрегулировать положение инъекции. Место инъекции должно начинаться с дистального конца. - После завершения инъекции быстро вытащите иглу и аккуратно прижмите место инъекции ватным тампоном. Верните мышь в новую чистую клетку и внимательно понаблюдайте за ней в течение нескольких минут на предмет каких-либо побочных эффектов.
5. Резекция первичной опухоли
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что все хирургические инструменты автоклавированы. Стерилизовать операционную зону внутри шкафа биобезопасности 75% этанолом с последующим УФ-облучением в течение не менее 30 минут. Во время операции носите чистые халаты, головные уборы, маски и стерильные перчатки.
- Когда опухоль прощупается (примерно 5 мм в диаметре), извлеките первичную опухоль.
- Обезболивайте мышей внутрибрюшинной инъекцией кетамина (75 мг/кг). Зажмите подушечку стопы, чтобы оценить степень анестезии, если болевого рефлекса нет, это указывает на правильное время для операции. Если задние конечности были удалены, обеспечьте еще одну дозу 10-30 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы внутрибрюшинный медетомидин (1 мг/кг массы тела; Domitor) рекомендуется для обезболивания мышей. - Нанесите на мышиные глаза защитную мазь от подсушивания. Удалите шерсть на животе с помощью крема для депиляции, чтобы полностью обнажить операционное поле.
- Поместите мышь в шкаф биобезопасности и положите ее на анатомическую доску, покрытую чистой впитывающей бумагой, в положении лежа на спине так, чтобы продольная ось мыши была параллельна экспериментатору.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания строгой стерильной среды следующие процедуры должны выполняться в шкафу биобезопасности. - Продезинфицируйте брюшную полость мышей ватным тампоном, смоченным в повидон-йоде. Надрезать кожу возле места носителя опухоли стерильным скальпелем или офтальмологическими ножницами. Вставьте закрытый кончик ножниц в разрез, чтобы четко обнажить опухоль. При разрезании кожи следите за тем, чтобы не повредить паховые лимфатические узлы.
- Во время удаления опухоли держите капсулу максимально неповрежденной. Аккуратно и аккуратно удалите соединительную ткань, прилегающую к опухоли, стерильными ножницами. Удаляйте опухоль на месте полностью, иначе она может рецидивировать.
6. Интранодальное введение клеток B16F10-GP в паховый лимфатический узел
ПРИМЕЧАНИЕ: После двустороннего очищения опухоли клетки B16F10-GP вводились в односторонний паховый лимфатический узел, а PBS вводился в другую сторону.
- Аспирировать 20 мкл (5 x 10,4 клетки) клеточной суспензии B16F10-GP инсулиновым шприцем 100 U, удалить пузырьки и затем ввести в один паховый лимфатический узел. Введите равный объем PBS в паховый лимфатический узел с другой стороны.
- Во время инъекции вводят иглу с дистального конца лимфатического узла, а затем медленно вводят иглу в центр лимфатического узла. В это время, если жидкость точно вводится в лимфатический узел, можно заметить, что лимфатический узел значительно увеличивается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда игла вводится из дистального конца лимфатического узла, следите за тем, чтобы не проколоть узел.
- Во время инъекции вводят иглу с дистального конца лимфатического узла, а затем медленно вводят иглу в центр лимфатического узла. В это время, если жидкость точно вводится в лимфатический узел, можно заметить, что лимфатический узел значительно увеличивается.
- Зашить разрез 2-3 швами, используя шов 3-0. Продезинфицируйте кожу вокруг раны ватой, пропитанной повидон-йодом. Позаботьтесь о шунтировании лимфатических узлов во время наложения швов.
- Поместите мышь в чистую клетку и согрейте инфракрасным светом в положении пролежня. Наблюдайте непрерывно до тех пор, пока сознание не восстановится. Следите за тем, чтобы мыши, перенесшие операцию, не возвращались в компанию других животных до полного выздоровления.
- Назначайте бупренорфин каждые 4-6 ч в течение 3 дней подряд после операции для облегчения послеоперационной боли (в дозе 0,1-0,5 мг/кг, SQ или IP). Следите за зонами кормления, питья, движения и активности мышей. Обычно мыши восстанавливаются после хирургической травмы в течение 3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мыши не могут возобновить нормальное кормление и активность и проявляют какие-либо признаки инфекции, обратитесь к ветеринару для вмешательства или усыпите их. - Жертвоприношение мышей в разные моменты времени: на 8-й и 18-й день после интранодальной инъекции опухолевых клеток. Извлечение активированных донорских клеток с помощью анализа проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Принципиальная схема этого экспериментального проекта показана на рисунке 1А. В общей сложности 5 x 105 клеток B16F10-GP в 100 мкл PBS были подкожно имплантированы в двустороннюю паховую область мышей CD45.2 C57BL/6J. Через 7 дней этим мышам с опухолью внутривенно (в/в) вводили 4 мг CTX с последующим адоптивным переносом 5 x 105 клеток CD45.1+P14 через хвостовую внутривенную (внутривенную) инъекцию. Когда опухоли вырастали примерно до 3-5 мм в диаметре (примерно через 7 дней после переноса клеток P14), первичные опухоли резецировали, и 5 x 104 клеток B16F10-GP в 20 мкл PBS вводили непосредственно в односторонний паховый лимфатический узел. В паховый лимфатический узел с другой стороны вводили равные объемы PBS. Репрезентативное окрашивание гематоксилином и эозином (H&E, 100x) неметастатического лимфатического узла (nLN) и метастатического лимфатического узла (mLN) в указанные моменты времени показано на рисунке 1B. Структура nLN осталась нетронутой. На ранней стадии метастазирования ВН (D8) mLN был частично занят опухолевыми клетками (черная стрелка), и еще остается некоторый участок с лимфоцитами, которые не были захвачены опухолевыми клетками (красная стрелка). В то время как на поздней стадии метастазирования ВН (D18) mLN заполнен опухолевыми клетками, сопровождающимися опухолевым ангиогенезом и малым количеством лимфоцитов. Активированные клетки Р14, восстановленные в TdLN, продуцировали высокий уровень ИФН-γ после стимуляции пептидами GP33-41 9,31. Здесь процентное соотношение активированных клеток P14 было проанализировано с помощью проточной цитометрии в разные моменты времени, а стратегия стробирования показана на рисунке 2. Частота антиген-специфических CD8+ Т-клеток в периферической крови на ранней стадии (D8) и поздней (D18) составляет 2,81% и 1,48% соответственно (рис. 3А). Сообщалось, что опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки строго находятся в dLN во время опухолегенеза, а недренирующие LN восстанавливают ограниченные донорские клетки33. Процент антиген-специфических клеток Р14 в нЛН был стабильным при метастазировании ВН. Интересно, что антиген-специфические CD8+ Т-клетки в мЛН были временно усилены на ранней стадии, о чем свидетельствует более высокая частота клеток Р14 по сравнению с нЛН, в то время как на поздней стадии она резко снизилась (рис. 3Б).
Рисунок 1: Принципиальная схема схемы эксперимента. (A) Мышам C57BL/6J (CD45.2+) имплантируют 5 x 105 опухолевых клеток B16F10-GP в двустороннюю паховую область. Через 7 дней этим мышам внутрибрюшинно вводят 4 мг CTX, а затем на следующий день проводят адоптивный перенос различных конконгенически маркированных (CD45.1+) клеток P14. Когда опухоли вырастают примерно до 3-5 мм в диаметре (примерно через 7 дней после переноса клеток P14), первичные опухоли резецируют, затем 5 x 104 клеток B16F10-GP в 20 мкл PBS вводят непосредственно в односторонний паховый лимфатический узел, а в паховый лимфатический узел с другой стороны вводят равные объемы PBS. (B) Репрезентативное окрашивание ЛН гематоксилином и эозином (H&E,100x). Сокращения: s.c. = подкожный; CTX= циклофосфамид; в/в = внутривенно; Сак = жертвоприношение; nLN = неметастатическая LN; мЛН = метастатическая ВН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия стробирования для анализа проточной цитометрии. Стратегия стробирования, используемая для идентификации донорских активированных антиген-специфических CD8+ Т-клеток. Аббревиатуры: L/D = живой/мертвый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Динамика антиген-специфических CD8+ Т-клеток при метастазировании в ЛН. Доля антиген-специфических CD8+ Т-клеток в (А) периферической крови, (В) нЛН и мЛН в разные моменты времени. Сокращения: nLN = неметастатическая LN; мЛН = метастатическая ВН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во время онкогенеза антигенпрезентирующие клетки (APC) поглощают опухолевые антигены и мигрируют в TdLN, где они праймируют CD8+ Т-клетки. После прайминга и активации CD8+ Т-клетки покидают TdLN и проникают в опухоль, убивая опухолевые клетки10. Благодаря резекции TdLN и введению FTY720, которые блокируют выход иммунных клеток из лимфоидных органов, несколько исследований продемонстрировали ключевую роль TdLN в обеспечении эффективности терапии контрольных точек PD-1/PD-L134,35. В соответствии с этим, мы недавно обнаружили, что опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки памяти (TTSM) преимущественно находятся в TdLN, эти TdLN-TTSM клетки служат добросовестными ответчиками на ICB9. К сожалению, некоторые типы раковых клеток часто распространяются на TdLN из первичных опухолевых участков, что приводит к структурному подтверждению и дисфункции иммунных клеток в TdLN. Нарушение количества и качества CD8+ Т-клеток в мЛН уже описано20,36. Однако динамические изменения CD8+ Т-клеток, особенно опухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток во время метастатического каскада ВН, не выяснены.
Разработана удобная мышиная модель для мониторинга динамики системных и локальных антиген-специфических CD8+ Т-клеток в процессе метастазирования ВН. Клетки меланомы B16F10-GP подкожно имплантировали в двустороннюю паховую область с последующим адоптивным переносом с клетками P14, которые могли быть специфически активированы пептидом, полученным из GPGP 33-41. На 7-е сутки после переноса клеток, когда клетки Р14 в паховых ЛН были полностью активированы, первичные опухоли с обеих сторон резецировались и клетки B16F10-GP вводились непосредственно в одностороннюю паховую ЛН, симуляция операции с другой стороны выполнялась путем инъекции с равными объемами PBS. Эта гениальная конструкция позволяет сравнивать клетки P14 в мЛН и неметастатической ЛН (нЛН) у одних и тех же мышей. Одновременно клетки Р14 в периферической крови у одних и тех же мышей были обнаружены в разные моменты времени во время метастазирования ВН путем кровотечения из орбитальной вены. Помимо частоты клеток P14 в периферической крови и TdLN на разных стадиях метастазирования LN, транскрипционные и эпигенетические свойства этих антиген-специфических CD8+ Т-клеток могут быть дополнительно изучены с помощью других методов.
Следует отметить, что некоторые шаги следует выполнять с осторожностью. Во-первых, первичные опухоли должны быть тщательно иссечены, так как остаточные опухолевые клетки будут быстро расти. Во-вторых, операция должна проводиться аккуратно, так как опухолевые ткани содержат большое количество новых кровеносных сосудов, которые обычно неизбежно разрываются при первичной резекции опухоли и приводят к гибели хирургических мышей из-за массивного кровоизлияния. Поэтому сроки первичной резекции опухоли имеют решающее значение. Как правило, его относительно безопасно удалять, когда опухоль вырастает до размера около 5 х 5 мм, и опухолевые клетки должны быть точно введены в ЛН, а не в нижние или соседние ткани. Кроме того, объем суспензий опухолевых клеток должен контролироваться ниже 20 мкл, в противном случае при разливе образуется новая опухоль за пределами ВН. Наконец, ограничением этого протокола является то, что операция травматична, и мыши могут столкнуться с инфекцией в процессе заживления, что повлияет на свойства антиген-специфических CD8+ Т-клеток. Поэтому критически важно соблюдать строгую асептизацию во время операции и делать фиктивную инъекцию PBS, чтобы исключить влияние индуцированного инъекцией физического повреждения антиген-специфических CD8+ Т-клеток.
В целом, мы предоставляем удобную модель для исследования антиген-специфических CD8+ Т-клеток во время метастазирования ВН, а также могут быть выяснены взаимодействия между антиген-специфическими CD8+ Т-клетками и другими иммунными клетками или клетками стромы во время метастазирования ВН. Кроме того, он может быть легко распространен на несколько других моделей опухолей. В совокупности этот протокол предлагает полезную репродуктивную модель для изучения иммунологии рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом выдающихся молодых ученых Китая (No 82122028 - LX), Национальным фондом естественных наук Китая (No 82173094 - LX), Фондом естественных наук Чун Цина (No 2023NSCQ-BHX0087 to SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
