Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ट्यूमरजेनेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए लिम्फ नोड मेटास्टेसिस मॉडल को निकालना

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65646
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 4, 1, 5, 4
1College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute of Cancer, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, 5Institute of life science, Chongqing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक डिजाइन लिम्फ नोड (एलएन) मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रजनन मॉडल प्रदान करता है, जो बाईस्टैंडर सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गड़बड़ी को बाहर करता है।

Abstract

लिम्फ नोड्स को निकालने से ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाएं ट्यूमरजेनेसिस के दौरान एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने में एक संचित महत्व प्राप्त करती हैं। हालांकि, कई मामलों में, कैंसर कोशिकाएं दूर के अंगों को आगे मेटास्टेसाइजिंग करने से पहले लिम्फ नोड्स में मेटास्टेटिक लोकी बनाती हैं। एलएन मेटास्टेसिस से स्थानीय और व्यवस्थित सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाएं किस हद तक प्रभावित थीं, यह अस्पष्ट है। यह अंत करने के लिए, हम एक B16F10-GP मेलेनोमा सेल लाइन के साथ संयुक्त एक murine LN मेटास्टेसिस मॉडल स्थापित करते हैं, जो लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिनजाइटिस वायरस (LCMV), ग्लाइकोप्रोटीन (GP), और P14 ट्रांसजेनिक चूहों से प्राप्त सरोगेट नियोएंटीजन को व्यक्त करता है टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) GP-व्युत्पन्न पेप्टाइड GP33-41 के लिए विशिष्ट वर्ग I प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (MHC) अणु H-2Db द्वारा प्रस्तुत किया गया। यह प्रोटोकॉल एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, C57BL/6J चूहों को चमड़े के नीचे B16F10-GP कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया था, इसके बाद भोले P14 कोशिकाओं के साथ दत्तक हस्तांतरण किया गया था। जब चमड़े के नीचे का ट्यूमर लगभग 5 मिमी व्यास तक बढ़ गया, तो प्राथमिक ट्यूमर को उत्तेजित किया गया, और B16F10-GP कोशिकाओं को सीधे ट्यूमर ड्रेनिंग लिम्फ नोड (TdLN) में इंजेक्ट किया गया। फिर, एलएन मेटास्टेसिस की प्रक्रिया के दौरान सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता की निगरानी की गई। सामूहिक रूप से, इस मॉडल ने एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की सटीक जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान किया है।

Introduction

कैंसर इम्यूनोथेरेपी, विशेष रूप से प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी (आईसीबी), ने कैंसर चिकित्सा1 में क्रांति ला दी है। ICB कॉइनहिबिटरी इम्यूनोरिसेप्टर्स (जैसे PD-1, Tim-3, LAG-3, और TIGIT) को ब्लॉक करता है, जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (TME) में थके हुए CD8+ T कोशिकाओं में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं, जिससे थका हुआ CD8+ T कोशिकाओं का पुनर्जीवनहोता है। थके हुए CD8+ T कोशिकाओं की विषमता को ध्यान में रखते हुए, साक्ष्य जमा करने से पता चला कि परिधि से प्राप्त ट्यूमर-विशिष्ट CD8+ T कोशिकाएं, जिनमें ड्रेनिंग लिम्फ नोड (dLN) शामिल हैं, लेकिन TME में नहीं, ICB 3,4,5,6,7,8की प्रभावकारिता में मध्यस्थता करती हैं। हाल ही में, टीडीएलएन व्युत्पन्न टीसीएफ-1+टीओएक्स-ट्यूमर-विशिष्ट मेमोरी सीडी8+ टी कोशिकाओं (टीडीएलएन-टीटीएसएम) को आईसीबी के वास्तविक उत्तरदाता होने की पुष्टि की गई थी जो पारंपरिक मेमोरी टी कोशिकाओं के कई कार्यात्मक गुणों को मूर्त रूप देते हैं और आईसीबी उपचार9 पर संतान समाप्त कोशिकाओं में आगे विस्तार और अंतर कर सकते हैं। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों ने एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा को बढ़ाने में एलएन के महत्व की पुष्टि की।

लिम्फ नोड संरचनात्मक आधार के साथ-साथ जैविक संकेत10प्रदान करके ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के भड़काना और सक्रियण को सुविधाजनक बनाने में एक महत्वपूर्ण स्थान के रूप में कार्य करता है। कई प्रकार के कैंसर कोशिकाएं अक्सर व्यवस्थित प्रसार से पहले प्रहरी लिम्फ नोड (एसएलएन, पहला एलएन प्राथमिक ट्यूमर निकालना) बीजदेती हैं। एसएलएन मेटास्टेसिस की उपस्थिति मानव कैंसर में खराब परिणाम से जुड़ी हुई है और प्रीक्लिनिकल मॉडल से पता चला है कि टीडीएलएन में ट्यूमर कोशिकाएं नोड 12,13,14,15के लसीका वाहिकाओं और रक्त वाहिकाओं दोनों के माध्यम से दूर के अंगों में फैल सकती हैं। एसएलएन बायोप्सी अब कई ठोस ट्यूमर प्रकारों में बाद के उपचार निर्णयों को निर्देशित करने के लिए एक मानक प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करती है जो असंबद्ध एलएन 16,17के अनावश्यक लकीर से बच सकती है। यहां तक कि शामिल एलएन के लिए, यह विवादास्पद है कि क्या और जब शल्य चिकित्सा लकीर की जरूरत है के रूप में कई अध्ययनों से पता चला है कि क्षेत्रीय एलएन को हटाने क्षेत्रीय एलएन लकीर18,19 के बिना विकिरण या प्रणालीगत चिकित्सा प्राप्त करने वालों की तुलना में समग्र अस्तित्व में सुधार प्रदर्शन नहीं किया है. एक व्याख्या यह है कि सूक्ष्म रोग के साथ मेटास्टैटिक एलएन (एमएलएन) प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शिक्षित करने और कुछ चिकित्सीय लाभ प्रदान करने की कुछ क्षमता बनाए रख सकता है। इसलिए, यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि एलएन मेटास्टेसिस एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कैसे प्रभावित करता है, विशेष रूप से टीडीएलएन-टीटीएसएम के गुण और कार्य।

अब तक, प्रीक्लिनिकल और क्लिनिकल डेटा दोनों ने एमएलएन20 में कुछ संरचनात्मक और सेलुलर परिवर्तनों का खुलासा किया है। हालांकि, एलएन मेटास्टेसिस के दौरान ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गतिशील परिवर्तनों को चित्रित नहीं किया गया है। इसलिए, आगे की जांच के लिए एलएन मेटास्टेसिस का एक सम्मोहक मॉडल विकसित करना आवश्यक है। दरअसल, कई अध्ययनों ने एमएलएन माउस मॉडल को विभिन्न तरीकोंसे 14,21,22 की सूचना दी है। उदाहरण के लिए, एक्सिलरी एलएन में सहज मेटास्टेसिस स्तन वसा पैड22 में 4 टी 1 स्तन कैंसर कोशिकाओं के आरोपण के माध्यम से आयोजित किया गया था। एक अन्य अध्ययन में, रेटिकर-फ्लिन एट अल ने अलग-अलग एमएलएन ऊतकों (नौ राउंड)14से सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं के धारावाहिक टीकाकरण के माध्यम से चमड़े के नीचे प्राथमिक ट्यूमर से एलएन तक फैलने की उच्च घटनाओं के साथ मेलेनोमा सेल लाइनें उत्पन्न कीं। एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा फुटपैड में तैयार किया गया था और मेटास्टैटिक लोकी पॉप्लिटल एलएन22 में बनाया जाएगा। विशेष रूप से, हस्तक्षेप के सटीक समय बिंदुओं का मूल्यांकन करना मुश्किल है क्योंकि इन मॉडलों में एलएन मेटास्टेसिस हमेशा वफादार नहीं होता है।

वर्तमान अध्ययन में, बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं23,24 के इंट्रानोडल इंजेक्शन के माध्यम से एक मुराइन एलएन मेटास्टैटिक मॉडल स्थापित किया गया था, जो बी 16 एफ 10 सेल लाइन9 के जीनोम में एलसीएमवी वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) जीन अनुक्रम के सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9-मध्यस्थता सम्मिलन द्वारा उत्पन्न किया गया था। फिर, इन चूहों को पी 14 कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित किया गया था जो ट्रांसजेनिक टी सेल रिसेप्टर्स (टीसीआर) को विशेष रूप से एच -2 डीबी जीपी33-41 एपिटोप25,26 को पहचानते हैं और एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रणालीगत और स्थानीय गतिशीलता की जांच की जा सकती है। हमारा प्रयोगात्मक डिजाइन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान करता है, विशेष रूप से एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाएं जो बाईस्टैंडर सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गड़बड़ी को बाहर करती हैं। ये परिणाम एमएलएन को हटाने या बनाए रखने के नैदानिक उपचार विकल्पों को प्रभावित करेंगे और अधिकतम चिकित्सीय लाभ प्राप्त करने के लिए एमएलएन के हेरफेर पर नई रोशनी डालेंगे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

C57BL/6J चूहों (बी 6 चूहों को संदर्भित) और भोले P14 ट्रांसजेनिक चूहों 9,27 का इस्तेमाल 6-10 सप्ताह की उम्र में 18-22 ग्राम वजन के थे। पुरुष और महिला दोनों को यादृच्छिककरण या अंधा किए बिना शामिल किया गया था। सभी पशु अध्ययन क़िंगदाओ कृषि विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे।

1. मध्यम और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. डीएमईएम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% एल-ग्लूटामाइन को अतिरिक्त 100 यू/एमएल प्यूरोमाइसिन के साथ जोड़कर डी 10 (पूर्ण डीएमईएम माध्यम) नामक बी 16 एफ 10-जीपी मेलेनोमा सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें। एक बाँझ D10 बनाए रखें और 2-4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर करें।
  2. 2% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1% एल-ग्लूटामाइन के साथ आरपीएमआई -1640 जोड़कर आर 2 माध्यम (लाल रक्त कोशिका लसीका की समाप्ति के लिए) तैयार करें।
  3. 2% एफबीएस और सोडियम एज़ाइड के 0.01% के साथ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) जोड़कर प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस) बफर तैयार करें। सोडियम एज़ाइड के अलावा एफएसीएस बफर के भंडारण समय को लम्बा खींच सकता है, जिसे 2-4 डिग्री सेल्सियस पर महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. डबल आसुत जल में 155 एमएम एनएच4सीएल, 10 एमएम केएचसीओ3, और 0.1 एमएम एथिलीनडायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) जोड़कर लाल रक्त कोशिका लसीका (आरबीएल) बफर तैयार करें और इसके पीएच को 7.3 तक समायोजित करें। RBL बफर को कमरे के तापमान (RT) पर स्टोर करें और यह 3 महीने तक स्थिर रहता है.
  5. संवेदनाहारी, 2,2,2-ट्राइब्रोमोएथेनॉल तैयार करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे 50 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में 2,2,2-ट्राइब्रोमोएथेनॉल क्रिस्टल की उचित मात्रा का वजन करें। एमएल की एकाग्रता के साथ स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए क्रिस्टल में 2-मिथाइल-2-ब्यूटेनॉल की उचित मात्रा जोड़ें।
    2. क्रिस्टल भंग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब को मिश्रण और गर्म करने के लिए इसे घुमाएं। सुनिश्चित करें कि सभी क्रिस्टल भंग हो गए हैं।
    3. घोल को अच्छी तरह मिला लें। एक बाँझ कंटेनर में एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ शेयर समाधान फ़िल्टर. जमे हुए स्टॉक समाधान को स्टोर करें, प्रकाश से परिरक्षित, -20 डिग्री सेल्सियस पर या पीबीएस के साथ 12.5 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में काम करने वाले समाधान में पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
      नोट: निर्धारित एकाग्रता का उपयोग करना सबसे अच्छा है क्योंकि तरल की उच्च सांद्रता परेशान कर रही है।

2. B16F10-GP सेल निलंबन की तैयारी

  1. पिघलना और संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में डी 10 के 5 एमएल के साथ 1 x 106 बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं की एक शीशी। उपसंस्कृति कोशिकाओं जब वे नीचे वर्णित के रूप में 80% से 90% घनत्व तक पहुंच गए।
    1. एक पाइपिंग बंदूक के साथ आकांक्षा द्वारा मूल संस्कृति माध्यम को त्यागें और कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 2x धोएं। सेल कल्चर डिश में पीबीएस के साथ पक्षपाती कोशिकाओं की सफाई करते समय, पीबीएस को साइड वॉल पर ले जाएं या इसे डिश में छोड़ दें।
    2. पीबीएस की आकांक्षा के बाद, सेल कल्चर डिश या फ्लास्क में 0.25% ट्रिप्सिन ईडीटीए समाधान के 0.5-1 एमएल जोड़ें। धीरे पूरे सेल सतह को कवर करने के लिए हिला. सेल कल्चर डिश या फ्लास्क को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 मिनट के लिए या आरटी पर रखें जब तक कि कोशिकाओं को गोल और अलग न किया जाए। एक उल्टे माइक्रोस्कोप की मदद से कोशिकाओं के छूटना का निरीक्षण करें.
    3. ट्रिप्सिन पाचन को समाप्त करने के लिए ताजा तैयार डी 10 की बराबर मात्रा जोड़ें। सेल कल्चर फ्लास्क की निचली सतह को एक पाइपिंग बंदूक के साथ शुद्ध करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी कोशिकाओं को अलग किया गया था।
    4. आरटी पर 4 मिनट के लिए 163 x ग्राम पर 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए बी 16 एफ 10-जीपी सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
    5. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और त्याग. वर्षा के लिए डी 10 के 1-2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। बी 16 एफ 10-जीपी सेल निलंबन को एक नए सेल कल्चर डिश या फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें डी 10 के 8-10 एमएल शामिल हैं और फिर 5% सीओ2 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  2. ट्यूमर आरोपण के दिन, लगभग 90% की घनत्व के साथ B16F10-GP कोशिकाओं को इकट्ठा करें जैसा कि चरण 2.1.1 से 2.1.4 में वर्णित है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला और त्यागने के लिए महाप्राण करें। पीबीएस के 1 एमएल में सेल अवक्षेप को फिर से निलंबित करें।
  3. एक 0.4% trypan नीले hemocytometer का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गणना. सेल को 5 x 105 कोशिकाओं प्रति 100 माइक्रोन में पतला करने के लिए पीबीएस जोड़ें। उपयोग होने तक कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।

3. चूहों के द्विपक्षीय वंक्षण क्षेत्र में B16F10-GP कोशिकाओं का एक्टोपिक टीकाकरण

  1. 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके तैयार बी 16 एफ 10-जीपी सेल निलंबन के 100 माइक्रोन को एस्पिरेट करें। बुलबुले को ऊपर की ओर ले जाने के लिए ट्यूब की दीवार को झटका दें और शीर्ष बुलबुले को बाहर निकालने के लिए पिस्टन को धक्का दें।
  2. एक लापरवाह स्थिति में माउस पकड़ो, उसके पेट को उजागर. एक उंगली के साथ लापरवाह स्थिति में माउस के दाहिने हिंद अंग प्रेस इतना है कि सही वंक्षण क्षेत्र में त्वचा पूरी तरह से उजागर है (बाएं वंक्षण क्षेत्र के साथ ही).
  3. डिपिलिटरी क्रीम के साथ पेट पर फर निकालें, फिर 75% इथेनॉल युक्त कपास के साथ द्विपक्षीय पेट क्षेत्र को साफ करें।
  4. सुई डालने से पहले, सुनिश्चित करें कि वंक्षण क्षेत्र में त्वचा कड़ी हो गई है। ऊपरी जांघ के वंक्षण क्षेत्र के चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में एक 45 डिग्री कोण पर सुई डालें. सुनिश्चित करें कि सुई ऊपर की ओर beveled है और 0.5-1 सेमी करने के लिए सुई की गहराई.
  5. इंजेक्शन से पहले कोमल चूषण लागू करें, यदि कोई रक्त नहीं है, तो कोशिकाओं को धीरे-धीरे चमड़े के नीचे के ऊतक में इंजेक्ट करें। उसी समय, चमड़े के नीचे के क्षेत्र में एक छोटे से बोलस (द्रव जेब का गठन) का निरीक्षण करें।
  6. इंजेक्शन के बाद, सुई को हटा दें, इसे शार्प बॉक्स में डाल दें, और माउस को उसके पिंजरे में लौटा दें।

4. ट्यूमर असर चूहों में P14 टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण

  1. ट्यूमर आरोपण के बाद 6-8 दिनों ट्यूमर असर चूहों में दत्तक हस्तांतरण प्रदर्शन, जब ट्यूमर स्पष्ट (व्यास में लगभग 3-5 मिमी) कर रहे हैं. इंट्रापेरिटोनली स्थानांतरण 28,29,30 से एक दिन पहले 4 मिलीग्राम साइक्लोफॉस्फेमाइड इंजेक्ट करें।
    नोट: सीटीएक्स इंजेक्शन का उद्देश्य लिम्फोसाइटों के प्रसार को क्षणिक रूप से समाप्त करके दत्तक रूप से स्थानांतरित टी कोशिकाओं के लिए लसीका डिब्बे में जगह बनाना है।
  2. 31,32 (6-10 सप्ताह पुराना, अस्वीकृति के मुद्दों से बचने के लिए ट्यूमर-असर चूहों के समान लिंग) के रूप में भोले P14 ट्रांसजेनिक चूहों की प्लीहा और LNs से लिम्फोसाइटों को अलग करें।
    नोट: सख्ती से बाँझ स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में निम्नलिखित प्रक्रियाएं करें।
    1. दो 6 सेमी व्यंजन तैयार करें और एक व्यंजन में आर 2 मध्यम के 3 एमएल और दूसरे डिश में आरबीएल बफर के 3 एमएल जोड़ें। आरबीएल बफर युक्त पेट्री डिश में 70 माइक्रोन सेल फिल्टर रखें।
    2. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद isoflurane युक्त airtight कंटेनर में P14 चूहों इच्छामृत्यु. प्राप्तकर्ता चूहों की संख्या के अनुसार P14 चूहों की संख्या को समायोजित करें.
    3. इच्छामृत्यु चूहों से प्लीहा, वंक्षण और एक्सिलरी लिम्फ नोड्स की कटाई करें और उन्हें आर 2 माध्यम के 4 एमएल युक्त 6 सेमी व्यंजन में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
    4. आरबीएल बफर के 3 एमएल के साथ भिगोए गए एक छलनी में प्लीहा रखें, प्लीहा को 1 एमएल सिरिंज के अंदर पुटर के साथ पीस लें। 1-2 मिनट के लिए आरटी पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, फिर ठंड आर 2 माध्यम के 3 एमएल के साथ प्रतिक्रिया को समाप्त करें।
    5. 1 एमएल सिरिंज के अंदर पुटर के साथ एलएन को पीसें जब तक कि केवल संयोजी ऊतक 70 माइक्रोन सेल फिल्टर के साथ छलनी में रहता है। ठंडे R2 माध्यम के साथ फिल्टर कुल्ला और एक नया 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिन के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन से flocculent सामग्री को हटाने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल फिल्टर का प्रयोग करें.
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिन के लिए 500 x ग्राम पर सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें। एक छोटा सा नमूना लें, ट्रिपैन ब्लू के साथ मिलाएं, और रक्त कोशिका गिनती प्लेट का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  3. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा P14 (लाइव/डेड-CD45.1+CD8+Vα2+) कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि स्थानांतरित दाता कोशिकाएं प्राप्तकर्ता चूहों के साथ अलग-अलग जन्मजात मार्कर प्रदर्शित करती हैं (ट्यूमर-असर बी 6 चूहों सीडी 45.2 + है)। स्थानांतरित कोशिकाओं के सही फेनोटाइप को सत्यापित करने के लिए स्थानांतरण से पहले धुंधला प्रदर्शन करें।
    1. एफएसीएस बफर के 1 एमएल युक्त 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5 x 104- 1 x 105 कोशिकाओं को जोड़ें। 3 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, कोशिकाओं तितर-बितर करने के लिए ट्यूब के नीचे झटका है, और बर्फ पर ट्यूब जगह है.
    3. निम्नलिखित संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रणतैयार करें 9,32 एफएसीएस बफर के 100 माइक्रोन में पतला: एंटी-सीडी 8, 1:200; एंटी-टीसीआर Vα2, 1:100; एंटी-सीडी 45.1, 1:200; लाइव/डेड स्टेन, 1:400। (सामग्री की तालिका)।
    4. कणों को एकत्र करने के लिए 3 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर एंटीबॉडी मिश्रण को अपकेंद्रित्र करें। मिश्रण को बर्फ पर रखें और इसे पन्नी में लपेटकर प्रकाश से बचाएं। कणों की आकांक्षा से बचने के लिए केवल सतह पर तैरनेवाला लें।
    5. एंटीबॉडी मिश्रण के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और ट्यूब की दीवार को फ्लिक करके अच्छी तरह मिलाएं। टिन पन्नी में लपेटने के बाद, बर्फ पर 30 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं.
    6. FACS बफर के साथ कोशिकाओं 2x धो लें. 3 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। एफएसीएस बफर के 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को प्रवाह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. लाइव/डेड-सीडी45.1+सीडी8+वीα2+ कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमीटर पर सना हुआ कोशिकाओं के साथ फ्लो ट्यूब चलाएं।
      नोट: आम तौर पर, P14 ट्रांसजेनिक चूहों से CD8+ T कोशिकाओं के 90% से अधिक ने Vα2+TCRs को परेशान किया, जो LCMV (लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिनजाइटिस वायरस) के H-2Db GP33-41 एपिटोप के लिए विशिष्ट हैं।
  4. लाइव/डेड-CD45.1+CD8+Vα2+ कोशिकाओं की पूर्ण संख्या की गणना इसके प्रतिशत और चरण 4.2 और 4.3 में प्राप्त लाइव सेल नंबर को गुणा करके करें।
  5. 100 यू इंसुलिन सिरिंज के साथ P14 सेल (5 x 105 कोशिकाओं ) निलंबन के 200 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और बुलबुले को हटा दें। स्थानांतरित भोले पी 14 कोशिकाओं (5 x 103 - 5 x 105) की प्रारंभिक संख्या नेस्थानांतरित कोशिकाओं 9 के फेनोटाइप को प्रभावित नहीं किया।
  6. एक पिंजरे में चूहों रखें और पूंछ नस का विस्तार करने के लिए 5-10 मिनट के लिए एक अवरक्त दीपक के साथ गर्म. एक उचित आकार माउस फिक्सेटर के साथ जगह में पकड़ो, पूंछ सीधा, और नसों को दृश्यमान बनाने के लिए 75% इथेनॉल युक्त एक कपास की गेंद के साथ पोंछ.
  7. पूंछ नस के समानांतर सुई डालें और धीरे सवार वापस खींच. यदि सिरिंज में रक्त बह रहा है, तो धीरे-धीरे सेल निलंबन को नस में धकेलें।
    नोट: यदि इंजेक्शन के दौरान पूंछ का प्रतिरोध या सूजन है, तो इंजेक्शन की स्थिति को समायोजित करने की आवश्यकता है। इंजेक्शन साइट बाहर का अंत में शुरू करना चाहिए.
  8. इंजेक्शन पूरा होने के बाद, सुई को जल्दी से बाहर निकालें और इंजेक्शन साइट को कपास की गेंद से धीरे से दबाएं। माउस को एक नए साफ पिंजरे में लौटाएं और किसी भी प्रतिकूल प्रभाव के लिए कई मिनट तक इसका बारीकी से निरीक्षण करें।

5. प्राथमिक ट्यूमर की लकीर

नोट: सुनिश्चित करें कि सभी सर्जिकल उपकरण उपयोग करने से पहले आटोक्लेव किए गए हैं। 75% इथेनॉल के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर ऑपरेटिंग क्षेत्र को स्टरलाइज़ करें, इसके बाद कम से कम 30 मिनट के लिए यूवी विकिरण करें। सर्जरी के दौरान साफ गाउन, टोपी, मास्क और बाँझ दस्ताने पहनें।

  1. जब ट्यूमर स्पष्ट होता है (व्यास में लगभग 5 मिमी), प्राथमिक ट्यूमर को काटना।
  2. केटामाइन (75 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। एनेस्थीसिया की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए पिंच फुट पैड, अगर कोई दर्द पलटा नहीं है, तो यह सर्जरी के लिए सही समय इंगित करता है। यदि हिंद अंगों को वापस ले लिया गया था, तो 10-30 माइक्रोन की एक और खुराक प्रदान करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इंट्रापेरिटोनियल मेडिटोमिडाइन (1 मिलीग्राम / डोमिटर) को चूहों को एनेस्थेटाइज करने की सिफारिश की जाती है।
  3. माउस आंखों पर सुखाने निवारक मरहम लागू करें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र को पूरी तरह से उजागर करने के लिए डिपिलिटरी क्रीम के साथ पेट पर फर निकालें।
  4. माउस को जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें और इसे एक लापरवाह स्थिति में साफ शोषक कागज से ढके एक शारीरिक बोर्ड पर रखें ताकि माउस का अनुदैर्ध्य अक्ष प्रयोगकर्ता के समानांतर हो।
    नोट: एक सख्त बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए, जैव सुरक्षा कैबिनेट में निम्नलिखित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
  5. पोविडोन-आयोडीन में भिगोए गए कपास की गेंद के साथ चूहों के पेट कीटाणुरहित करें। एक बाँझ स्केलपेल या नेत्र कैंची के साथ ट्यूमर असर साइट के पास त्वचा चीरा. स्पष्ट रूप से ट्यूमर को बेनकाब करने के लिए चीरा में बंद कैंची टिप डालें. त्वचा को उकसाते समय, सुनिश्चित करें कि वंक्षण लिम्फ नोड्स को नुकसान न पहुंचे।
  6. ट्यूमर हटाने के दौरान, कैप्सूल को यथासंभव बरकरार रखें। ध्यान से और धीरे बाँझ कैंची के साथ ट्यूमर से सटे संयोजी ऊतक को हटा दें. ट्यूमर को पूरी तरह से सीटू में हटा दें, अन्यथा यह पुनरावृत्ति हो सकती है।

6. वंक्षण लिम्फ नोड में B16F10-GP कोशिकाओं का इंट्रानोडल इंजेक्शन

नोट: द्विपक्षीय ट्यूमर निकासी के बाद, बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं को एकतरफा वंक्षण लिम्फ नोड में इंजेक्ट किया गया था और पीबीएस को दूसरी तरफ इंजेक्ट किया गया था।

  1. 100 यू इंसुलिन सिरिंज के साथ बी 16 एफ 10-जीपी सेल निलंबन के 20 माइक्रोन (5 x 104 कोशिकाओं) को एस्पिरेट करें, बुलबुले को हटा दें और फिर एक वंक्षण लिम्फ नोड में इंजेक्ट करें। दूसरी तरफ वंक्षण लिम्फ नोड में पीबीएस की एक समान मात्रा इंजेक्ट करें।
    1. इंजेक्शन के दौरान, लिम्फ नोड के बाहर का अंत से सुई डालें, और फिर धीरे-धीरे लिम्फ नोड के केंद्र में सुई डालें। इस समय, यदि द्रव को लिम्फ नोड में सटीक रूप से इंजेक्ट किया जाता है, तो लिम्फ नोड को काफी सूज जाते देखा जा सकता है।
      नोट: जब सुई लिम्फ नोड के बाहर का अंत से डाला जाता है, नोड पंचर करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें.
  2. 3-0 सिवनी का उपयोग करके 2-3 टांके के साथ चीरा सीवन। पोविडोन आयोडीन के साथ गर्भवती कपास के साथ घाव के आसपास की त्वचा कीटाणुरहित करें। टांके लगाने के दौरान लिम्फ नोड्स को बायपास करने के लिए ध्यान रखें।
  3. माउस को एक साफ पिंजरे में रखें और पार्श्व डिकुबिटस स्थिति में अवरक्त प्रकाश का उपयोग करके गर्म रखें। चेतना बरामद होने तक लगातार निगरानी करें। सुनिश्चित करें कि सर्जरी से गुजर चुके चूहों को पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य जानवरों की कंपनी में वापस नहीं किया जाता है।
  4. पश्चात के दर्द से राहत पाने के लिए ऑपरेशन के बाद लगातार 3 दिनों के लिए हर 4-6 घंटे में ब्यूप्रेनोर्फिन दें (0.1-0.5 मिलीग्राम / किग्रा, एसक्यू या आईपी की खुराक पर)। खिला, पीने, आंदोलन, और चूहों की गतिविधि क्षेत्रों की निगरानी. आमतौर पर, चूहे 3 दिनों के भीतर सर्जिकल आघात से ठीक हो जाते हैं।
    नोट: यदि चूहों सामान्य खिला और गतिविधियों को फिर से शुरू करने और संक्रमण के किसी भी लक्षण दिखाने में असमर्थ हैं, हस्तक्षेप के लिए एक पशुचिकित्सा से परामर्श करें या इसे इच्छामृत्यु दें।
  5. अलग-अलग समय बिंदुओं पर चूहों का बलिदान: दिन 8 और दिन 18 ट्यूमर कोशिकाओं के इंट्रानोडल इंजेक्शन के बाद। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके सक्रिय दाता कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रयोगात्मक डिजाइन के योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1 ए में दिखाया गया है. पीबीएस के 100 माइक्रोन में कुल 5 x 105 बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं को सीडी 45.2 सी 57 बीएल / 6 जे चूहों के द्विपक्षीय वंक्षण क्षेत्र में चमड़े के नीचे (एससी) प्रत्यारोपित किया गया था। 7 दिनों के बाद, इन ट्यूमर-असर वाले चूहों को इंट्रापेरिटोनली (आईपी) 4 मिलीग्राम सीटीएक्स के साथ इंजेक्ट किया गया था, इसके बाद पूंछ अंतःशिरा (आईवी) इंजेक्शन के माध्यम से 5 x 105 सीडी 45.1 + पी 14 कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के बाद। जब ट्यूमर व्यास में लगभग 3-5 मिमी (पी 14 कोशिकाओं के हस्तांतरण के लगभग 7 दिन बाद) तक बढ़ गया, तो प्राथमिक ट्यूमर को काट दिया गया, और पीबीएस के 20 माइक्रोन में 5 x 104 बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं को सीधे एकतरफा वंक्षण लिम्फ नोड में इंजेक्ट किया गया। दूसरी तरफ वंक्षण लिम्फ नोड पीबीएस के बराबर मात्रा के साथ इंजेक्शन दिया गया था. संकेतित समय बिंदुओं पर गैर-मेटास्टैटिक लिम्फ नोड (एनएलएन) और मेटास्टैटिक लिम्फ नोड (एमएलएन) के प्रतिनिधि हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई, 100x) धुंधला हो जाना चित्रा 1 बी में दिखाया गया है। एनएलएन की संरचना बरकरार थी। एलएन मेटास्टेसिस (डी 8) के प्रारंभिक चरण में, एमएलएन आंशिक रूप से ट्यूमर कोशिकाओं (काला तीर) के साथ कब्जा कर लिया गया था, और लिम्फोसाइटों के साथ अभी भी कुछ शेष क्षेत्र है जो ट्यूमर कोशिकाओं (लाल तीर) द्वारा आक्रमण नहीं किया गया है। जबकि एलएन मेटास्टेसिस (डी 18) के देर के चरण में, एमएलएन ट्यूमर एंजियोजेनेसिस और छोटे लिम्फोसाइटों के साथ ट्यूमर कोशिकाओं से भरा होता है। टीडीएलएन में बरामद सक्रिय पी 14 कोशिकाओं ने जीपी33-41 पेप्टाइड उत्तेजना 9,31 के बाद आईएफएन -γ के उच्च स्तर का उत्पादन किया। यहां, सक्रिय पी 14 कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से किया गया था और गेटिंग रणनीति चित्रा 2में दिखाई गई है। प्रारंभिक चरण (D8) और देर से चरण (D18) में परिधीय रक्त में एंटीजन-विशिष्ट CD8+ T कोशिकाओं की आवृत्ति क्रमशः 2.81% और 1.48% है (चित्र 3A)। ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को ट्यूमरजेनेसिस और गैर-जल निकासी एलएन बरामद सीमित दाता कोशिकाओं33 के दौरान डीएलएन में सख्ती से रहने की सूचना मिली है। एनएलएन में एंटीजन-विशिष्ट पी 14 कोशिकाओं का प्रतिशत एलएन मेटास्टेसिस के दौरान स्थिर था। दिलचस्प बात यह है कि एमएलएन में एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को प्रारंभिक चरण में क्षणिक रूप से बढ़ाया गया था, जो एनएलएन की तुलना में पी 14 कोशिकाओं की उच्च आवृत्ति से प्रमाणित था, जबकि यह देर से चरण(चित्रा 3बी)में तेजी से कमी आई।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक डिजाइन के योजनाबद्ध आरेख। (ए) C57BL/6J चूहों (CD45.2+) को द्विपक्षीय वंक्षण क्षेत्र पर 5 x 105 B16F10-GP ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है। 7 दिनों के बाद, इन चूहों को इंट्रापेरिटोनली 4 मिलीग्राम सीटीएक्स के साथ इंजेक्ट किया जाता है, और इसके बाद अगले दिन विभिन्न जन्मजात रूप से चिह्नित (सीडी 45.1 +) पी 14 कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के बाद। जब ट्यूमर व्यास में लगभग 3-5 मिमी (पी 14 कोशिकाओं के हस्तांतरण के लगभग 7 दिन बाद) तक बढ़ते हैं, तो प्राथमिक ट्यूमर को उच्छेदन किया जाता है, फिर पीबीएस के 20 माइक्रोन में 5 x 104 बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं को सीधे एकतरफा वंक्षण लिम्फ नोड में इंजेक्ट किया जाता है, और दूसरी तरफ वंक्षण लिम्फ नोड को पीबीएस के बराबर मात्रा के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (बी) प्रतिनिधि हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई, 100x) एलएन का धुंधला हो जाना। संक्षिप्ताक्षर: एससी = चमड़े के नीचे; सीटीएक्स = साइक्लोफॉस्फेमाइड; वि० [सं०] = अंतःशिरा; थैली = बलिदान; एनएलएन = गैर-मेटास्टैटिक एलएन; mLN = मेटास्टैटिक LN। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति। गेटिंग रणनीति का उपयोग दाता-व्युत्पन्न सक्रिय एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। संक्षिप्ताक्षर: एल/डी = जीवित / कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता। (ए) परिधीय रक्त, (बी) एनएलएन और एमएलएन में अलग-अलग समय बिंदुओं पर एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का अनुपात। संक्षिप्ताक्षर: nLN = गैर-मेटास्टेटिक LN; mLN = मेटास्टैटिक LN। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ट्यूमरजेनेसिस के दौरान, एंटीजन-प्रेजेंटिंग सेल (APCs) ट्यूमर एंटीजन को घेर लेते हैं और TdLN में माइग्रेट हो जाते हैं जहां वे CD8+ T कोशिकाओं को प्राइम करते हैं। भड़काना और सक्रियण के बाद, सीडी 8 + टी कोशिकाओं TdLN छोड़ और ट्यूमर कोशिकाओं10 को मारने के लिए ट्यूमर घुसपैठ. TdLN लकीर और FTY720 के प्रशासन के माध्यम से जो लिम्फोइड अंगों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बाहर निकलने को अवरुद्ध करते हैं, कई अध्ययनों ने PD-1/PD-L1 चेकपॉइंट थेरेपी 34,35की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने में TdLN की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन किया है। इसके अनुरूप, हमने हाल ही में पाया कि ट्यूमर-विशिष्ट मेमोरी सीडी 8 + टी कोशिकाएं (टीटीएसएम) मुख्य रूप से टीडीएलएन में रहती हैं, ये टीडीएलएन-टीटीएसएम कोशिकाएं आईसीबी9 के लिए वास्तविक उत्तरदाताओं के रूप में काम करती हैं। दुर्भाग्य से, कई प्रकार की कैंसर कोशिकाएं अक्सर प्राथमिक ट्यूमर साइटों से टीडीएलएन में फैलती हैं, जो टीडीएलएन में संरचनात्मक पुन: पुष्टि और प्रतिरक्षा कोशिका की शिथिलता का कारण बनती हैं। एमएलएन में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की बिगड़ा हुआ मात्रा और गुणवत्ता पहले से ही20,36 वर्णित किया गया है। हालांकि, सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गतिशील परिवर्तन, विशेष रूप से एलएन मेटास्टैटिक कैस्केड के दौरान ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को स्पष्ट नहीं किया गया है।

यहां, हमने एलएन मेटास्टेसिस की प्रक्रिया के दौरान प्रणालीगत और स्थानीय एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक सुविधाजनक माउस मॉडल विकसित किया है। बी 16 एफ 10-जीपी मेलेनोमा कोशिकाओं को द्विपक्षीय वंक्षण क्षेत्र में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया गया था, इसके बाद पी 14 कोशिकाओं के साथ दत्तक रूप से स्थानांतरित किया गया था जिसे विशेष रूप से जीपी-व्युत्पन्न पेप्टाइड जीपी33-41 द्वारा सक्रिय किया जा सकता था। दिन 7 पोस्ट सेल स्थानांतरण में जब वंक्षण एलएन में पी 14 कोशिकाओं को पूरी तरह से सक्रिय किया गया था, दोनों पक्षों में प्राथमिक ट्यूमर को उच्छेदित किया गया था और बी 16 एफ 10-जीपी कोशिकाओं को सीधे एकतरफा वंक्षण एलएन में इंजेक्ट किया गया था, दूसरी तरफ शम ऑपरेशन पीबीएस के बराबर मात्रा के साथ इंजेक्शन के माध्यम से किया गया था। यह सरल डिजाइन एक ही चूहों के भीतर एमएलएन और गैर-मेटास्टैटिक एलएन (एनएलएन) में पी 14 कोशिकाओं की तुलना करने में सक्षम बनाता है। इसके साथ ही, एक ही चूहों के भीतर परिधि रक्त में पी 14 कोशिकाओं को कक्षीय शिरा रक्तस्राव द्वारा एलएन मेटास्टेसिस के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर पता लगाया गया था। एलएन मेटास्टेसिस के दौरान विभिन्न चरणों में परिधि रक्त और टीडीएलएन में पी 14 कोशिकाओं की आवृत्तियों के अलावा, इन एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल और एपिजेनेटिक गुणों की अन्य तकनीकों के साथ और जांच की जा सकती है।

ध्यान दें, कई चरणों को सावधानी से किया जाना चाहिए। सबसे पहले, प्राथमिक ट्यूमर को अच्छी तरह से उत्तेजित किया जाना चाहिए, क्योंकि अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाएं तेजी से फिर से बढ़ेंगी। दूसरे, ऑपरेशन को धीरे से किया जाना चाहिए, क्योंकि ट्यूमर के ऊतकों में प्रचुर मात्रा में नई रक्त वाहिकाएं होती हैं जो आमतौर पर प्राथमिक ट्यूमर लकीर के दौरान अनिवार्य रूप से टूट जाती हैं और बड़े पैमाने पर रक्तस्राव के कारण सर्जिकल चूहों की मृत्यु हो जाती है। इसलिए, प्राथमिक ट्यूमर लकीर का समय गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। आम तौर पर, इसे हटाने के लिए अपेक्षाकृत सुरक्षित होता है जब ट्यूमर लगभग 5 x 5 मिमी आकार तक बढ़ता है, और ट्यूमर कोशिकाओं को नीचे या आसन्न ऊतकों के बजाय एलएन में ठीक से इंजेक्ट किया जाना चाहिए। इसके अलावा, ट्यूमर सेल निलंबन की मात्रा को 20 माइक्रोन से नीचे नियंत्रित किया जाना चाहिए, अन्यथा फैल एलएन के बाहर नया ट्यूमर बना देगा। अंत में, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि ऑपरेशन दर्दनाक है, और चूहों को उपचार प्रक्रिया के दौरान संक्रमण का अनुभव हो सकता है, जो एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं के गुणों को प्रभावित करेगा। इसलिए, सर्जरी के दौरान सख्त एसेप्सिस बनाए रखना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है और एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को इंजेक्शन से प्रेरित शारीरिक क्षति के प्रभाव को बाहर करने के लिए शम-संचालित पीबीएस इंजेक्शन किया जाना चाहिए।

कुल मिलाकर, हम एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की जांच करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल प्रदान करते हैं और एलएन मेटास्टेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं या स्ट्रोमा कोशिकाओं के बीच बातचीत को भी स्पष्ट किया जा सकता है। इसके अलावा, इसे आसानी से कई अन्य ट्यूमर मॉडल तक बढ़ाया जा सकता है। सामूहिक रूप से, यह प्रोटोकॉल कैंसर इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रजनन मॉडल प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन फॉर आउटस्टैंडिंग यंग स्कॉलर्स ऑफ चाइना (नंबर 82122028 से एलएक्स), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 82173094 से एलएक्स), नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चोंग किंग (नंबर 2023NSCQ-BHX0087 से SW) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
  3. Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
  4. Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  5. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
  6. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
  7. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
  8. Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
  9. Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
  10. Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
  11. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  12. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  13. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  14. Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
  15. Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
  16. Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
  17. Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
  18. Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
  19. Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
  20. du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
  21. An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
  22. Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
  23. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
  25. Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
  26. Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
  27. Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
  28. North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
  29. Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
  30. Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
  31. Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
  32. Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
  33. Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
  34. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
  35. Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
  36. Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).

Tags

इस महीने जोव में अंक 203
ट्यूमरजेनेसिस के दौरान एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 <sup>+</sup> टी कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए लिम्फ नोड मेटास्टेसिस मॉडल को निकालना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue,… More

Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter