Summary
Den experimentella designen som presenteras här ger en användbar reproduktionsmodell för studier av antigenspecifika CD8+ T-celler under lymfkörtelmetastaser (LN), vilket utesluter störning av åskådare CD8+ T-celler.
Abstract
Tumörantigenspecifika CD8+ T-celler från dränerande lymfkörtlar får en ackumulerande betydelse för att öka antitumörimmunsvaret under tumörbildning. Men i många fall bildar cancerceller metastaserande loci i lymfkörtlarna innan de metastaserar vidare till avlägsna organ. I vilken utsträckning de lokala och systematiska CD8+ T-cellssvaren påverkades av LN-metastaser är fortfarande höljt i dunkel. För detta ändamål satte vi upp en murin LN-metastaseringsmodell kombinerad med en B16F10-GP melanomcellinje som uttrycker surrogatneoantigenet som härrör från lymfocytiskt koriomeningitvirus (LCMV), glykoprotein (GP) och P14-transgena möss som hyser T-cellsreceptorer (TCR) specifika för GP-härledd peptid GP33-41 som presenteras av klass I major histocompatibility complex (MHC) molekylen H-2Db. Detta protokoll möjliggör studier av antigenspecifika CD8+ T-cellssvar under LN-metastaser. I detta protokoll implanterades C57BL/6J-möss subkutant med B16F10-GP-celler, följt av adoptiv överföring med naiva P14-celler. När den subkutana tumören växte till cirka 5 mm i diameter avlägsnades den primära tumören och B16F10-GP-celler injicerades direkt i tumördränerande lymfkörteln (TdLN). Därefter övervakades dynamiken hos CD8+ T-celler under processen för LN-metastasering. Sammantaget har denna modell tillhandahållit ett tillvägagångssätt för att exakt undersöka de antigenspecifika CD8+ T-cellsimmunsvaren under LN-metastaser.
Introduction
Immunterapi mot cancer, särskilt immuncheckpointblockaden (ICB), har revolutionerat cancerterapin1. ICB blockerar de kohibitoriska immunreceptorerna (t.ex. PD-1, Tim-3, LAG-3 och TIGIT), som uttrycks i hög grad i utmattade CD8+ T-celler i tumörmikromiljön (TME), vilket leder till att utmattade CD8+ T-celleråterupplivas. Med tanke på heterogeniteten hos utmattade CD8+ T-celler, visade ackumulerade bevis att tumörspecifika CD8+ T-celler som härrör från periferin, inklusive dränerande lymfkörtlar (dLN), men inte i TME, medierar effekten av ICB 3,4,5,6,7,8. Nyligen bekräftades att TdLN-härledda TCF-1+TOX-tumörspecifika minnes-CD8+ T-celler (TdLN-TTSM) är de som verkligen svarar på ICB som förkroppsligar flera funktionella egenskaper hos konventionella minnes-T-celler och som ytterligare kan expandera och differentiera till avkommeutmattade celler vid ICB-behandling9. Sammantaget bekräftade dessa fynd vikten av LN för att öka antitumörimmuniteten.
Lymfkörteln fungerar som en kritisk plats för att underlätta priming och aktivering av tumörspecifika CD8+ T-celler genom att tillhandahålla strukturell bas såväl som biologiska signaler10. Flera typer av cancerceller befruktar ofta portvaktslymfkörtlar (SLN, det första LN som dränerar en primärtumör) innan de systematiskt sprids11. Förekomsten av SLN-metastaser är kopplad till dåligt utfall i human cancer och prekliniska modeller visade att tumörceller i TdLN kunde sprida sig till avlägsna organ genom både lymfkärlen och blodkärlen i noden 12,13,14,15. SLN-biopsi utgör nu en standardprocedur för att vägleda efterföljande behandlingsbeslut i många solida tumörtyper, vilket kan undvika onödig resektion av oinvolverad LN16,17. Även för den inblandade LN är det fortfarande kontroversiellt om och när kirurgisk resektion behövs eftersom flera studier har visat att avlägsnandet av regionalt LN inte uppvisade förbättrad total överlevnad jämfört med dem som fick strålning eller systemisk behandling utan regional LN-resektion18,19. En tolkning är att metastaserande LN (mLN) med mikroskopisk sjukdom kan behålla en viss förmåga att utbilda immunceller och ge vissa terapeutiska fördelar. Så det är mycket viktigt att klarlägga hur LN-metastaser påverkar immunsvaret mot tumörer, särskilt egenskaperna och funktionerna hos TdLN-TTSM.
Hittills har både prekliniska och kliniska data avslöjat vissa strukturella och cellulära förändringar i mLN20. De dynamiska förändringarna av tumörspecifika CD8+ T-celler under LN-metastasering har dock inte avgränsats. Därför behövs det att utveckla en övertygande modell för LN-metastaser för vidare forskning. Faktum är att flera studier har rapporterat mLN-musmodeller på olika sätt 14,21,22. Till exempel genomfördes spontan metastasering i axillära LN genom implantation av 4T1-bröstcancerceller i bröstfettkudden22. I en annan studie genererade Reticker-Flynn et al. melanomcellinjer med hög förekomst av spridning från subkutan primärtumör till LN genom seriell inokulering av tumörceller odlade från dissocierade mLN-vävnader (nio omgångar)14. En annan vanligt förekommande modell framställdes genom injektion av tumörceller i fotplattan och de metastaserande loci skulle bildas i popliteal LN22. Framför allt är det svårt att utvärdera de exakta tidpunkterna för interventionen eftersom LN-metastasering i dessa modeller inte alltid är trogen.
I den aktuella studien etablerades en murin LN-metastaseringsmodell genom intranodal injektion av B16F10-GP-celler23,24, genererad genom CRISPR/Cas9-medierad insättning av LCMV-virusglykoprotein (GP) gensekvens i genomet hos B16F10-cellinje 9. Sedan överfördes dessa möss med P14-celler som hyser transgena T-cellsreceptorer (TCR) som specifikt känner igen H-2Db GP33-41-epitopen 25,26 och den systemiska och lokala dynamiken hos antigenspecifika CD8+ T-celler under LN-metastasering kunde undersökas. Vår experimentella design ger en användbar modell för studier av immunsvar, särskilt de antigenspecifika CD8+ T-cellerna under LN-metastaseringen, vilket utesluter störning av åskådar-CD8+ T-celler. Dessa resultat skulle påverka de kliniska behandlingsalternativen för att ta bort eller behålla mLN och kasta nytt ljus över manipulationen av mLN för att uppnå maximala terapeutiska fördelar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J-mössen (refererade till B6-möss) och naiva P14-transgena möss 9,27 som användes var 6-10 veckor gamla och vägde 18-22 g. Både hane och hona inkluderades utan randomisering eller blindning. Alla djurstudier utfördes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee vid Qingdao Agricultural University.
1. Beredning av medium och reagenser
- Förbered B16F10-GP melanomcellodlingsmedium, kallat D10 (komplett DMEM-medium) genom att tillsätta DMEM, 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % penicillin/streptomycin, 1 % L-glutamin med ytterligare 100 E/ml puromycin. Förvara en steril D10 och förvara i upp till 2 veckor vid 2-4 °C.
- Förbered R2-medium (för avslutande av lys av röda blodkroppar) genom att tillsätta RPMI-1640 med 2 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin och 1 % L-glutamin.
- Förbered fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (FACS) genom att tillsätta 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 2 % FBS och 0,01 % natriumazid. Tillsatsen av natriumazid kan förlänga lagringstiden för FACS-bufferten, som kan lagras i månader vid 2-4 ° C.
- Förbered buffert för lys av röda blodkroppar (RBL) genom att tillsätta 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 och 0,1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i dubbeldestillerat vatten och justera dess pH till 7,3. Förvara RBL-bufferten i rumstemperatur (RT) och den förblir stabil i upp till 3 månader.
- Bered bedövningsmedlet, 2,2,2-tribrometanol, enligt beskrivningen nedan.
- Väg upp lämplig mängd 2,2,2-tribrometanolkristall i ett 50 ml sterilt koniskt rör insvept i aluminiumfolie. Tillsätt lämplig mängd 2-metyl-2-butanol till kristallen för att bereda stamlösningen med en koncentration på 500 mg/ml.
- Snurra den för att blanda och värma röret i ett 37 °C vattenbad tills kristallen är upplöst. Se till att alla kristaller är upplösta.
- Blanda lösningen ordentligt. Filtrera stamlösningen med ett 0,22 μm filter i en steril behållare. Förvara stamlösningen fryst, avskärmad från ljus, vid -20 °C eller späd med PBS till en arbetslösning i en koncentration av 12,5 mg/ml och förvarad vid 4 °C.
OBS: Det är bäst att använda den föreskrivna koncentrationen eftersom högre koncentrationer av vätskan är irriterande.
2. Beredning av cellsuspension av B16F10-GP
- Tina och odla en injektionsflaska med 1 x 106 B16F10-GP-celler med 5 ml D10 i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2 . Subkulturceller när de nådde 80 % till 90 % densitet enligt beskrivningen nedan.
- Kassera det ursprungliga odlingsmediet genom aspiration med en pipetteringspistol och tvätta cellerna 2x med PBS. När du rengör vidhäftande celler med PBS i en cellodlingsskål, flytta PBS till sidoväggen eller släpp den i skålen.
- Efter aspiration av PBS, tillsätt 0,5-1 ml 0,25 % trypsin EDTA-lösning till cellodlingsskålen eller kolven. Skaka försiktigt för att täcka hela cellytan. Placera cellodlingsskålen eller kolven i en inkubator vid 37 °C i ca 1 minut eller vid RT tills cellerna är rundade och separerade. Observera exfoliering av celler med hjälp av ett inverterat mikroskop.
- Tillsätt lika stor volym nyformulerat D10 för att avsluta trypsinnedbrytningen. Rensa den nedre ytan av cellodlingskolven med en pipetteringspistol för att säkerställa att alla celler separerades.
- Överför cellsuspensionen B16F10-GP till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 163 x g i 4 minuter vid RT.
- Aspirera supernatanten och kassera. Återsuspendera cellerna i 1-2 ml D10 för utfällning. Överför cellsuspensionen B16F10-GP till en ny cellodlingsskål eller kolv som innehåller 8–10 ml D10 och inkubera sedan i en cellinkubator vid 37 °C vid 5 % CO2 .
- På dagen för tumörimplantation, samla B16F10-GP-celler med en densitet på cirka 90 % enligt beskrivningen i steg 2.1.1 till 2.1.4. Efter centrifugering, aspirera supernatanten och kassera. Återsuspendera cellfällningen i 1 ml PBS.
- Räkna livskraftiga celler med en 0,4 % trypanblå hemocytometer. Tillsätt PBS för att späda cellen till 5 x 105 celler per 100 μL. Lägg cellerna på is tills de ska användas.
3. Ektopisk inokulering av B16F10-GP-celler i den bilaterala ljumskregionen hos möss
- Aspirera 100 μl beredd B16F10-GP-cellsuspension med en 1 ml spruta. Snärta rörväggen för att flytta bubblorna till toppen och tryck på kolven för att flytta ut den övre bubblan.
- Håll musen i ryggläge och exponera buken. Tryck musens högra bakben i ryggläge med ett finger så att huden i höger ljumskregion är helt exponerad (samma sak med vänster ljumskregion).
- Ta bort pälsen på buken med hårborttagningskräm och rengör sedan det bilaterala bukområdet med bomull som innehåller 75 % etanol.
- Innan du sätter in nålen, se till att huden i ljumskregionen är åtdragen. Stick in nålen i 45° vinkel i det subkutana utrymmet i ljumskregionen på övre delen av låret. Se till att nålen är avfasad uppåt och nålens djup till 0,5-1 cm.
- Sug försiktigt före injektionen, om det inte finns något blod, injicera cellerna långsamt injicerade i den subkutana vävnaden. Observera samtidigt en liten bolus (bildning av vätskeficka) i det subkutana området.
- Efter injektionen tar du bort nålen, lägger den i lådan för vassa föremål och sätter tillbaka musen i buren.
4. Adoptiv överföring av P14 T-celler till tumörbärande möss
- Utför adoptiv överföring i tumörbärande möss 6-8 dagar efter tumörimplantation, när tumörerna är palperbara (cirka 3-5 mm i diameter). Intraperitonealt injicera 4 mg cyklofosfamid dagen före överföring 28,29,30.
OBS: Syftet med CTX-injektion är att skapa utrymme i lymfatiska kompartmentet för adoptivt överförda T-celler genom att tillfälligt eliminera prolifererande lymfocyter. - Isolera lymfocyter från mjälte och LN hos naiva P14-transgena möss enligt beskrivningen nedan31,32 (6-10 veckor gamla, samma kön som tumörbärande möss för att undvika avstötningsproblem).
OBS: Utför följande procedurer i ett biosäkerhetsskåp för att säkerställa strikt sterila förhållanden.- Förbered två 6 cm skålar och tillsätt 3 ml R2 medium till en av rätterna och 3 ml RBL-buffert till den andra skålen. Placera ett 70 μm cellfilter i petriskålen som innehåller RBL-buffert.
- Avliva P14-möss i lufttäta behållare som innehåller isofluran följt av cervikal luxation. Justera antalet P14-möss efter antalet mottagarmöss.
- Skörda mjälten, ljuinal- och axillära lymfkörtlar från de avlivade mössen och överför dem till 6 cm skålar som innehåller 4 ml R2-medium och lägg dem på is.
- Placera mjälten i en sil indränkt med 3 ml RBL-buffert, mal mjälten med puttern inuti 1 ml sprutan. Inkubera cellerna vid RT i 1-2 minuter och avsluta sedan reaktionen med 3 ml kallt R2-medium.
- Mal LN med puttern inuti 1 ml sprutan tills endast bindväv finns kvar i silen med ett 70 μm cellfilter. Skölj filtret med kallt R2-medium och överför cellsuspensionen till ett nytt 15 ml centrifugrör. Centrifugera proverna vid 500 x g i 6 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna med 3 ml PBS. Använd ett 70 μm cellfilter för att avlägsna flockningsmaterial från cellsuspensionen.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 6 minuter vid 4 °C. Återsuspendera cellerna med 3 ml PBS och placera röret på is. Ta ett litet prov, blanda med trypanblått och räkna cellerna med hjälp av en blodkroppsräkningsplatta.
- Bestäm procentandelen P14-celler (levande/död-CD45.1+CD8+Vα2+) genom flödescytometri. Se till att de överförda donatorcellerna uppvisar distinkta kongena markörer med mottagande möss (tumörbärande B6-möss är CD45.2+). Utför färgning före överföring för att verifiera den korrekta fenotypen för de överförda cellerna.
- Tillsätt 5 x 104- 1 x 105 celler till ett 1,5 ml centrifugrör som innehåller 1 ml FACS-buffert. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g vid 4 °C i 3 min.
- Kassera supernatanten, snärta till botten av röret för att skingra cellerna och placera röret på is.
- Bered följande konjugerade antikroppsblandning 9,32 utspädd i 100 μl FACS-buffert: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Levande/död fläck, 1:400. (Materialförteckning).
- Centrifugera antikroppsblandningen vid 15 000 x g i 3 minuter för att aggregera partiklarna. Lägg blandningen på is och skydda den från ljus genom att slå in den i folie. Ta endast supernatanten för att undvika aspiration av partiklar.
- Återsuspendera cellerna i 100 μl av antikroppsblandningen och blanda ordentligt genom att snärta till rörväggen. Efter inslagning i aluminiumfolie, inkubera röret i 30 minuter på is.
- Tvätta cellerna 2 gånger med FACS-buffert. Centrifugera röret vid 500 x g vid 4 °C i 3 minuter. Återsuspendera cellerna med 200 μl FACS-buffert och överför cellsuspensionen till ett flödesrör.
- Kör flödesröret med färgade celler på en flödescytometer för att bestämma procententage av levande/döda-CD45.1+CD8+Vα2+-celler.
OBS: I allmänhet hade över 90 % av CD8 + T-cellerna från P14-transgena möss Vα2 + TCR, som är specifika för H-2Db GP33-41-epitop av LCMV (lymfocytiskt koriomeningitvirus).
- Beräkna det absoluta antalet levande/döda CD45.1+CD8+Vα2+ -celler genom att multiplicera dess procentandel och antalet levande celler som erhålls i steg 4.2 och 4.3.
- Aspirera 200 μL P14-cellsuspension (5 x 105 celler) med en 100 U insulinspruta och ta bort bubblor. Det initiala antalet överförda naiva P14-celler (5 x 103 - 5 x 105) påverkade inte fenotypen för överförda celler9.
- Placera mössen i en bur och värm med en infraröd lampa i 5-10 minuter för att expandera svansvenen. Håll på plats med en musfixator av lämplig storlek, räta ut svansen och torka av den med en bomullstuss som innehåller 75 % etanol för att göra venerna synliga.
- Stick in nålen parallellt med svansvenen och dra försiktigt tillbaka kolvenen. Om blod strömmar in i sprutan, tryck långsamt in cellsuspensionen i venen.
OBS: Om det finns motstånd eller svullnad i svansen under injektionen måste injektionspositionen justeras. Injektionsstället ska börja i den distala änden. - När injektionen är klar drar du snabbt ut nålen och trycker försiktigt på injektionsstället med en bomullstuss. Sätt tillbaka musen i en ny ren bur och observera den noga i flera minuter för eventuella negativa effekter.
5. Resektion av primärtumören
OBS: Se till att alla kirurgiska instrument är autoklaverade före användning. Sterilisera operationsområdet inuti biosäkerhetsskåpet med 75 % etanol, följt av UV-bestrålning i minst 30 minuter. Bär rena rockar, hattar, masker och sterila handskar under operationen.
- När tumören är palperbar (ca 5 mm i diameter), avlägsna den primära tumören.
- Bedöva mössen med intraperitoneal injektion av Ketamin (75 mg/kg). Nyp fotdynan för att utvärdera graden av anestesi, om det inte finns någon smärtreflex indikerar det rätt tidpunkt för operation. Om bakbenen har dragits ut, ge ytterligare en dos på 10-30 μL.
OBS: Alternativt intraperitonealt medetomidin (1 mg/kg kroppsvikt; Domitor) rekommenderas för att bedöva möss. - Applicera den torkande förebyggande salvan på musögon. Ta bort pälsen på buken med hårborttagningskräm för att helt exponera det kirurgiska området.
- Placera musen i ett biosäkerhetsskåp och placera den på en anatomisk tavla täckt med rent absorberande papper i ryggläge så att musens längsgående axel är parallell med försöksledaren.
OBS: För att upprätthålla en strikt steril miljö måste följande procedurer utföras i ett biosäkerhetsskåp. - Desinficera mössens buk med en bomullstuss indränkt i povidonjod. Skär in huden nära det tumörbärande stället med en steril skalpell eller en optalmusisk sax. Sätt in den stängda saxspetsen i snittet för att tydligt exponera tumören. När du skär i huden ska du se till att inte skada ljumsklymfkörtlarna.
- När tumören tas bort ska kapseln hållas så intakt som möjligt. Ta försiktigt och försiktigt bort bindväven intill tumören med en steril sax. Ta bort tumören in situ helt, annars kan den återkomma.
6. Intranodal injektion av B16F10-GP-celler i ljumsklymfkörteln
OBS: Efter bilateral tumörläkning injicerades B16F10-GP-celler i unilateral ljumsklymfkörtel och PBS injicerades i den andra sidan.
- Aspirera 20 μL (5 x 104 celler) B16F10-GP cellsuspension med en 100 U insulinspruta, ta bort bubblor och injicera sedan i en ljumsklymfkörtel. Injicera en lika stor volym PBS i ljumsklymfkörteln på andra sidan.
- Under injektionen för du in nålen från den distala änden av lymfkörteln och för sedan långsamt in nålen i mitten av lymfkörteln. Vid denna tidpunkt, om vätskan injiceras korrekt i lymfkörteln, kan lymfkörteln ses svullna avsevärt.
OBS: När nålen förs in från den distala änden av lymfkörteln, se till att inte punktera noden.
- Under injektionen för du in nålen från den distala änden av lymfkörteln och för sedan långsamt in nålen i mitten av lymfkörteln. Vid denna tidpunkt, om vätskan injiceras korrekt i lymfkörteln, kan lymfkörteln ses svullna avsevärt.
- Suturera snittet med 2-3 stygn med en 3-0 sutur. Desinficera huden som omger såret med bomull impregnerad med povidonjod. Var noga med att kringgå lymfkörtlarna under sutureringen.
- Placera musen i en ren bur och håll den varm med infrarött ljus i sidoläge. Övervaka kontinuerligt tills medvetandet är återställt. Se till att möss som har genomgått operation inte återförs till andra djurs sällskap förrän de är helt återställda.
- Ge buprenorfin var 4-6:e timme under 3 dagar i följd efter operationen för att lindra postoperativ smärta (i en dos på 0,1-0,5 mg/kg, SQ eller IP). Övervaka mössens matnings-, drick-, rörelse- och aktivitetsområden. Vanligtvis återhämtar sig möss från kirurgiskt trauma inom 3 dagar.
OBS: Om möss inte kan återuppta normal utfodring och aktiviteter och visar några tecken på infektion, kontakta en veterinär för ingripande eller avliva den. - Offra möss vid olika tidpunkter: dag 8 och dag 18 efter intranodal injektion av tumörceller. Återvinna aktiverade donatorceller med hjälp av flödescytometrianalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det schematiska diagrammet över denna experimentella design visas i figur 1A. Totalt 5 x 105 B16F10-GP-celler i 100 μL PBS implanterades subkutant (s.c.) i den bilaterala ljumskregionen hos CD45.2 C57BL/6J-möss. Efter 7 dagar injicerades dessa tumörbärande möss intraperitonealt (i.p.) med 4 mg CTX, följt av adoptiv överföring av 5 x 105 CD45.1+P14-celler genom intravenös (intravenös (intravenös) svansinjektion. När tumörerna växte till cirka 3-5 mm i diameter (cirka 7 dagar efter överföring av P14-celler) avlägsnades primära tumörer och 5 x 104 B16F10-GP-celler i 20 μL PBS injicerades direkt i unilateral ljumsklymfkörtel. Ljumsklymfkörteln på andra sidan injicerades med lika stora volymer PBS. Representativ färgning av hematoxylin och eosin (H&E, 100x) av icke-metastaserad lymfkörtel (nLN) och metastaserad lymfkörtel (mLN) vid angivna tidpunkter visas i figur 1B. Strukturen för nLN var intakt. I det tidiga skedet av LN-metastasering (D8) var mLN delvis upptagen av tumörceller (svart pil), och det finns fortfarande ett område kvar med lymfocyter som inte har invaderats av tumörceller (röd pil). I det sena stadiet av LN-metastasering (D18) är mLN fylld med tumörceller åtföljda av tumörangiogenes och små lymfocyter. Aktiverade P14-celler som återfanns i TdLN producerade höga nivåer av IFN-γ efter GP33-41 peptidstimulering 9,31. Här analyserades procentandelen aktiverade P14-celler genom flödescytometri vid olika tidpunkter och gatingstrategin visas i figur 2. Frekvensen av antigenspecifika CD8+ T-celler i perifert blod i tidigt stadium (D8) och sent stadium (D18) är 2,81 % respektive 1,48 % (figur 3A). Tumörspecifika CD8+ T-celler har rapporterats finnas i dLN under tumörbildning och icke-dränerande LN-återvunna begränsade donatorceller33. Andelen antigenspecifika P14-celler i nLN var stabil under LN-metastaser. Intressant nog var antigenspecifika CD8+ T-celler i mLN övergående förstärkta i det tidiga stadiet, vilket framgår av den högre frekvensen av P14-celler jämfört med nLN, medan den minskade kraftigt i det sena stadiet (Figur 3B).
Figur 1: Schematisk bild av försöksuppställningen. (A) C57BL/6J-möss (CD45.2+) implanteras med 5 x 105 B16F10-GP tumörceller i den bilaterala ljumskregionen. Efter 7 dagar injiceras dessa möss intraperitonealt med 4 mg CTX, och följs av adoptiv överföring av olika kongent märkta (CD45.1+) P14-celler nästa dag. När tumörer växer till cirka 3-5 mm i diameter (cirka 7 dagar efter överföring av P14-celler), avlägsnas primära tumörer, sedan injiceras 5 x 104 B16F10-GP-celler i 20 μL PBS direkt i unilateral ljumsklymfkörtel, och ljumsklymfkörteln på andra sidan injiceras med lika stora volymer PBS. B) Representativ färgning av LN med hematoxylin och eosin (H&E,100x). Förkortningar: s.c. = subkutant; CTX= cyklofosfamid; i.v. = intravenös; Sac = offer; nLN = icke-metastaserande LN; mLN = metastaserande LN. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Regleringsstrategi för flödescytometrianalys. Regleringsstrategi som används för att identifiera donatorhärledda aktiverade antigenspecifika CD8+ T-celler. Förkortningar: L/D = levande/död. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Dynamik hos antigenspecifika CD8+ T-celler under LN-metastaser. Andelen antigenspecifika CD8+ T-celler i (A) perifert blod, (B) nLN och mLN vid olika tidpunkter. Förkortningar: nLN = icke-metastaserande LN; mLN = metastaserande LN. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under tumörgenes uppslukar antigenpresenterande celler (APC) tumörantigener och migrerar till TdLN där de primar CD8+ T-celler. Efter priming och aktivering lämnar CD8+ T-celler TdLN och infiltrerar tumören för att döda tumörceller10. Genom TdLN-resektion och administrering av FTY720 som blockerar immuncellernas utträde från lymfoida organ, har flera studier visat den centrala roll som TdLN spelar för att säkerställa effekten av PD-1/PD-L1 checkpointterapi34,35. I överensstämmelse med detta fann vi nyligen att tumörspecifika minnes-CD8+ T-celler (TTSM) huvudsakligen finns i TdLN, dessa TdLN-TTSM-celler fungerar som bona fide responders till ICB9. Tyvärr sprider sig flera typer av cancerceller ofta till TdLN från primära tumörer, vilket leder till strukturell återbekräftelse och immuncellsdysfunktion i TdLN. Den försämrade kvantiteten och kvaliteten av CD8+ T-celler i mLN har redan beskrivits20,36. De dynamiska förändringarna av CD8+ T-celler, särskilt de tumörantigenspecifika CD8+ T-cellerna under LN-metastaskaskaden, har dock inte klarlagts.
Här utvecklade vi en bekväm musmodell för att övervaka dynamiken hos systemiska och lokala antigenspecifika CD8+ T-celler under processen för LN-metastaser. B16F10-GP melanomceller implanterades subkutant i den bilaterala ljumskregionen, följt av adoptivöverföring med P14-celler som specifikt kunde aktiveras av den GP-härledda peptiden GP33-41. På dag 7 efter cellöverföring, när P14-celler i ljumsk-LN var fullt aktiverade, primärtumörer på båda sidor avlägsnades och B16F10-GP-celler injicerades direkt i unilateral ljumsk-LN, utfördes skenoperation på andra sidan genom injektionen med lika stora volymer PBS. Denna geniala design gör det möjligt att jämföra P14-celler i mLN och icke-metastaserande LN (nLN) inom samma möss. Samtidigt detekterades P14-celler i periferiblod hos samma möss vid olika tidpunkter under LN-metastasering genom blödning i orbitalvenen. Bortsett från frekvenserna av P14-celler i periferiblod och TdLN i olika stadier under LN-metastaser, kan de transkriptionella och epigenetiska egenskaperna hos dessa antigenspecifika CD8+ T-celler undersökas ytterligare med andra tekniker.
Observera att flera steg bör utföras försiktigt. För det första bör de primära tumörerna avlägsnas noggrant, eftersom de kvarvarande tumörcellerna skulle växa ut snabbt. För det andra bör operationen utföras försiktigt, eftersom tumörvävnader innehåller rikligt med nya blodkärl som vanligtvis oundvikligen bryts under primär tumörresektion och leder till att kirurgiska möss dör på grund av massiv blödning. Därför är tidpunkten för primär tumörresektion kritiskt viktig. I allmänhet är det relativt säkert att ta bort den när tumören växer till storleken cirka 5 x 5 mm, och tumörceller bör injiceras exakt i LN snarare än i botten eller intilliggande vävnader. Dessutom bör volymen av tumörcellssuspensioner kontrolleras under 20 μL, annars skulle spill bilda nya tumörer utanför LN. Slutligen är en begränsning med detta protokoll att operationen är traumatisk och att möss kan uppleva infektion under läkningsprocessen, vilket skulle påverka egenskaperna hos antigenspecifika CD8+ T-celler. Därför är det mycket viktigt att upprätthålla strikt aseptik under operationen och skenopererad PBS-injektion bör göras för att utesluta effekten av injektionsinducerad fysisk skada på de antigenspecifika CD8+ T-cellerna.
Sammantaget tillhandahåller vi en bekväm modell för att undersöka de antigenspecifika CD8+ T-cellerna under LN-metastasering och interaktionerna mellan antigenspecifika CD8+ T-celler och andra immunceller eller stromaceller under LN-metastasering kan också klarläggas. Dessutom skulle det lätt kunna utvidgas till flera andra tumörmodeller. Sammantaget erbjuder detta protokoll en användbar reproduktionsmodell för studier av cancerimmunologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr 82122028 till LX), National Natural Science Foundation of China (nr 82173094 till LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr 2023NSCQ-BHX0087 till SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
