Summary
Il disegno sperimentale qui presentato fornisce un utile modello riproduttivo per gli studi delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante le metastasi linfonodali (LN), che esclude la perturbazione delle cellule T CD8+ astanti.
Abstract
Le cellule T CD8+ specifiche dell'antigene tumorale provenienti dai linfonodi drenanti acquisiscono un'importanza crescente nel montare la risposta immunitaria antitumorale durante la tumorigenesi. Tuttavia, in molti casi, le cellule tumorali formano loci metastatici nei linfonodi prima di metastatizzare ulteriormente in organi distanti. Fino a che punto le risposte locali e sistematiche delle cellule T CD8+ siano state influenzate dalle metastasi dei LN rimane oscuro. A tal fine, abbiamo messo a punto un modello murino di metastasi LN combinato con una linea cellulare di melanoma B16F10-GP che esprime il neoantigene surrogato derivato dal virus della coriomeningite linfocitaria (LCMV), dalla glicoproteina (GP) e da topi transgenici P14 che ospitano recettori delle cellule T (TCR) specifici per il peptide GP33-41 derivato da GP presentato dalla molecola del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I H-2Db. Questo protocollo consente lo studio delle risposte antigene-specifiche delle cellule T CD8+ durante le metastasi dei LN. In questo protocollo, i topi C57BL/6J sono stati impiantati per via sottocutanea con cellule B16F10-GP, seguite da trasferimento adottivo con cellule P14 naive. Quando il tumore sottocutaneo è cresciuto fino a circa 5 mm di diametro, il tumore primario è stato asportato e le cellule B16F10-GP sono state iniettate direttamente nel linfonodo drenante del tumore (TdLN). Successivamente, la dinamica delle cellule T CD8+ è stata monitorata durante il processo di metastasi dei LN. Collettivamente, questo modello ha fornito un approccio per studiare con precisione le risposte immunitarie delle cellule T CD8+ specifiche dell'antigene durante le metastasi dei LN.
Introduction
L'immunoterapia del cancro, in particolare il blocco del checkpoint immunitario (ICB), ha rivoluzionato la terapia del cancro1. L'ICB blocca gli immunorecettori coinibitori (come PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), che sono altamente espressi nelle cellule T CD8+ esauste nel microambiente tumorale (TME), portando al rinvigorimento delle cellule T CD8+ esauste2. Considerando l'eterogeneità delle cellule T CD8+ esaurite, l'accumulo di prove ha rivelato che le cellule T CD8+ specifiche del tumore derivate dalla periferia, incluso il linfonodo drenante (dLN), ma non nella TME, mediano l'efficacia dell'ICB 3,4,5,6,7,8. Recentemente, è stato confermato che le cellule T CD8+ di memoria tumore-specifiche TCF-1 + TOX derivate da TdLN (TdLN-TTSM) sono le vere risposte all'ICB che incorporano diverse proprietà funzionali delle cellule T di memoria convenzionali e potrebbero ulteriormente espandersi e differenziarsi in cellule esaurite dalla progenie dopo il trattamento con ICB9. Nel complesso, questi risultati hanno corroborato l'importanza della LN nel montare l'immunità antitumorale.
Il linfonodo funge da punto critico nel facilitare l'innesco e l'attivazione delle cellule T CD8+ specifiche del tumore, fornendo una base strutturale e segnali biologici10. Diversi tipi di cellule tumorali spesso seminano il linfonodo sentinella (SLN, il primo LN che drena un tumore primario) prima della disseminazione sistematica11. La presenza di metastasi SLN è legata a scarsi risultati nel cancro umano e i modelli preclinici hanno mostrato che le cellule tumorali in TdLN potrebbero diffondersi a organi distanti sia attraverso i vasi linfatici che attraverso i vasi sanguigni dei linfonodi 12,13,14,15. La biopsia SLN rappresenta ora una procedura standard per guidare le successive decisioni terapeutiche in molti tipi di tumori solidi, evitando la resezione non necessaria di LN16,17 non coinvolti. Anche per i LN coinvolti, rimane controverso se e quando sia necessaria la resezione chirurgica, poiché diversi studi hanno dimostrato che la rimozione dei LN regionali non ha mostrato un miglioramento della sopravvivenza globale rispetto a quelli che hanno ricevuto radioterapia o terapia sistemica senza resezione regionale18,19. Un'interpretazione è che la LN metastatica (mLN) con malattia microscopica possa mantenere una certa capacità di educare le cellule immunitarie e fornire alcuni benefici terapeutici. Quindi, è di fondamentale importanza chiarire come le metastasi di LN influenzino la risposta immunitaria antitumorale, in particolare le proprietà e le funzioni di TdLN-TTSM.
Fino ad ora, sia i dati preclinici che quelli clinici hanno rivelato alcune alterazioni strutturali e cellulari in mLN20. Tuttavia, i cambiamenti dinamici delle cellule T CD8+ tumore-specifiche durante le metastasi dei LN non sono stati delineati. Pertanto, lo sviluppo di un modello convincente di metastasi LN è necessario per ulteriori indagini. In effetti, diversi studi hanno riportato modelli murini mLN in modi diversi 14,21,22. Ad esempio, le metastasi spontanee nei LN ascellari sono state condotte attraverso l'impianto di cellule di carcinoma mammario 4T1 nel cuscinetto adiposomammario 22. In un altro studio, Reticker-Flynn et al. hanno generato linee cellulari di melanoma con un'elevata incidenza di diffusione dal tumore primario sottocutaneo ai LN attraverso l'inoculazione seriale di cellule tumorali coltivate da tessuti mLN dissociati (nove round)14. Un altro modello comunemente usato è stato preparato mediante l'iniezione di cellule tumorali nel cuscinetto plantare e i loci metastatici si sarebbero formati nel LN22 popliteo. In particolare, è difficile valutare i tempi precisi dell'intervento perché le metastasi dei LN in questi modelli non sono sempre fedeli.
Nel presente studio, è stato stabilito un modello metastatico murino di LN attraverso l'iniezione intranodale di cellule B16F10-GP23,24, generate dall'inserzione mediata da CRISPR/Cas9 della sequenza genica della glicoproteina del virus LCMV (GP) nel genoma della linea cellulareB16F10 9. Quindi, questi topi sono stati trasferiti con cellule P14 che ospitano recettori transgenici delle cellule T (TCR) che riconoscono specificamente l'epitopo H-2Db GP33-41 25,26 e la dinamica sistemica e locale delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante le metastasi LN potrebbe essere studiata. Il nostro disegno sperimentale fornisce un modello utile per lo studio delle risposte immunitarie, in particolare delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante le metastasi dei LN che esclude la perturbazione delle cellule T CD8+ astanti. Questi risultati influenzerebbero le opzioni di trattamento clinico sull'opportunità di rimuovere o trattenere l'mLN e getterebbero nuova luce sulla manipolazione dell'mLN per ottenere i massimi benefici terapeutici.
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Protocol
I topi C57BL/6J (riferiti ai topi B6) e i topi transgenici naïve P14 9,27 utilizzati avevano un'età compresa tra 6 e 10 settimane e un peso di 18-22 g. Sia i maschi che le femmine sono stati inclusi senza randomizzazione o accecamento. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Agraria di Qingdao.
1. Preparazione del terreno e dei reagenti
- Preparare il terreno di coltura cellulare di melanoma B16F10-GP, denominato D10 (terreno DMEM completo) aggiungendo DMEM, 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di penicillina/streptomicina, 1% L-glutammina con ulteriori 100 U/mL di puromicina. Mantenere un D10 sterile e conservare per un massimo di 2 settimane a 2-4 °C.
- Preparare il terreno R2 (per la terminazione della lisi dei globuli rossi) aggiungendo RPMI-1640 con il 2% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di L-glutammina.
- Preparare il tampone FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) aggiungendo 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con FBS al 2% e 0,01% di azoturo di sodio. L'aggiunta di azoturo di sodio può prolungare il tempo di conservazione del tampone FACS, che può essere conservato per mesi a 2-4 ° C.
- Preparare il tampone di lisi dei globuli rossi (RBL) aggiungendo 155 mM di NH4Cl, 10 mM di KHCO3 e 0,1 mM di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) in acqua bidistillata e regolare il pH a 7,3. Conservare il tampone RBL a temperatura ambiente (RT) e rimane stabile fino a 3 mesi.
- Preparare l'anestetico, 2,2,2-tribromoetanolo, come descritto di seguito.
- Pesare una quantità appropriata di cristallo di 2,2,2-tribromoetanolo in una provetta conica sterile da 50 mL avvolta con un foglio di alluminio. Aggiungere una quantità appropriata di 2-metil-2-butanolo nel cristallo per preparare la soluzione madre con la concentrazione di 500 mg/mL.
- Agitare per mescolare e riscaldare il tubo a bagnomaria a 37 °C fino a quando il cristallo non si è sciolto. Assicurati che tutti i cristalli siano disciolti.
- Mescolare accuratamente la soluzione. Filtrare la soluzione madre con un filtro da 0,22 μm in un contenitore sterile. Conservare la soluzione madre congelata, al riparo dalla luce, a -20 °C o diluire con PBS in una soluzione di lavoro alla concentrazione di 12,5 mg/mL e conservata a 4 °C.
NOTA: È meglio utilizzare la concentrazione prescritta poiché concentrazioni più elevate del liquido sono irritanti.
2. Preparazione della sospensione cellulare B16F10-GP
- Scongelare e coltivare un flaconcino di 1 x 106 cellule B16F10-GP con 5 mL di D10 in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO2 . Cellule di sottocoltura quando hanno raggiunto l'80-90% di densità come descritto di seguito.
- Scartare il terreno di coltura originale mediante aspirazione con una pistola di pipettaggio e lavare le cellule 2 volte con PBS. Quando si puliscono le cellule aderenti con PBS in un piatto di coltura cellulare, spostare il PBS sulla parete laterale o lasciarlo cadere nel piatto.
- Dopo l'aspirazione del PBS, aggiungere 0,5-1 mL di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25% al piatto o al pallone di coltura cellulare. Agitare delicatamente fino a coprire l'intera superficie cellulare. Porre la piastra o il matraccio per colture cellulari in un incubatore a 37 °C per circa 1 minuto o a RT fino a quando le cellule non sono arrotondate e separate. Osserva l'esfoliazione delle cellule con l'aiuto di un microscopio invertito.
- Aggiungere un volume uguale di D10 appena formulato per interrompere la digestione della tripsina. Spurgare la superficie inferiore del pallone di coltura cellulare con una pistola di pipettaggio per assicurarsi che tutte le cellule siano state separate.
- Trasferire la sospensione cellulare B16F10-GP in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 163 x g per 4 minuti a RT.
- Aspirare il surnatante e scartarlo. Risospendere le cellule in 1-2 mL di D10 per la precipitazione. Trasferire la sospensione cellulare B16F10-GP in un nuovo piatto o matraccio contenente 8-10 mL di D10 e quindi incubare in un incubatore cellulare a 37 °C al 5% di CO2 .
- Il giorno dell'impianto del tumore, raccogliere le cellule B16F10-GP con una densità di circa il 90% come descritto nei passaggi da 2.1.1 a 2.1.4. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e gettarlo. Risospendere il precipitato cellulare in 1 mL di PBS.
- Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro blu tripano allo 0,4%. Aggiungere PBS per diluire la cella a 5 x 105 cellule per 100 μL. Mettere le cellule su ghiaccio fino al momento dell'uso.
3. Inoculazione ectopica di cellule B16F10-GP nella regione inguinale bilaterale dei topi
- Aspirare 100 μL di sospensione cellulare B16F10-GP preparata utilizzando una siringa da 1 mL. Scuotere la parete del tubo per spostare le bolle verso l'alto e spingere il pistone per spostare la bolla superiore verso l'esterno.
- Tenere il topo in posizione supina, esponendo l'addome. Premere l'arto posteriore destro del topo in posizione supina con un dito in modo che la pelle della regione inguinale destra sia completamente esposta (lo stesso vale per la regione inguinale sinistra).
- Rimuovere il pelo sull'addome con una crema depilatoria, quindi pulire la zona bilaterale dell'addome con cotone contenente il 75% di etanolo.
- Prima di inserire l'ago, assicurarsi che la pelle nella regione inguinale sia tesa. Inserire l'ago con un angolo di 45° nello spazio sottocutaneo della regione inguinale della parte superiore della coscia. Assicurarsi che l'ago sia smussato verso l'alto e che la profondità dell'ago sia di 0,5-1 cm.
- Applicare un'aspirazione delicata prima dell'iniezione, se non c'è sangue, iniettare lentamente le cellule iniettate nel tessuto sottocutaneo. Allo stesso tempo, osservare un piccolo bolo (formazione di una sacca di liquido) nella regione sottocutanea.
- Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago, metterlo nella scatola degli oggetti taglienti e riportare il topo nella sua gabbia.
4. Trasferimento adottivo di cellule T P14 in topi portatori di tumore
- Eseguire il trasferimento adottivo in topi portatori di tumore 6-8 giorni dopo l'impianto del tumore, quando i tumori sono palpabili (circa 3-5 mm di diametro). Iniettare per via intraperitoneale 4 mg di ciclofosfamide il giorno prima del trasferimento 28,29,30.
NOTA: Lo scopo dell'iniezione di CTX è quello di creare spazio nel compartimento linfatico per le cellule T trasferite adottivamente eliminando transitoriamente i linfociti proliferanti. - Isolare i linfociti dalla milza e dai LN di topi transgenici P14 naïve come descritto di seguito31,32 (6-10 settimane di età, lo stesso sesso dei topi portatori di tumore per evitare problemi di rigetto).
NOTA: Eseguire le seguenti procedure in una cabina di sicurezza biologica per garantire condizioni rigorosamente sterili.- Preparare due piatti da 6 cm e aggiungere 3 ml di R2 medium a uno dei piatti e 3 ml di tampone RBL all'altro piatto. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm nella capsula di Petri contenente il tampone RBL.
- Eutanasia i topi P14 in contenitori ermetici contenenti isoflurano seguita da lussazione cervicale. Regolare il numero di mouse P14 in base al numero di mouse riceventi.
- Prelevare la milza, i linfonodi inguinali e ascellari dai topi sottoposti a eutanasia e trasferirli in piastre da 6 cm contenenti 4 ml di terreno R2 e posti su ghiaccio.
- Mettere la milza in un colino imbevuto di 3 ml di tampone RBL, macinare la milza con il putter all'interno della siringa da 1 ml. Incubare le cellule a RT per 1-2 minuti, quindi terminare la reazione con 3 mL di terreno R2 freddo.
- Macinare gli LN con il putter all'interno della siringa da 1 mL fino a quando nel filtro rimane solo il tessuto connettivo con un filtro cellulare da 70 μm. Sciacquare il filtro con terreno R2 freddo e trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare i campioni a 500 x g per 6 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospendere le cellule con 3 mL di PBS. Utilizzare un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere il materiale flocculante dalla sospensione cellulare.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 6 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule con 3 mL di PBS e posizionare la provetta sul ghiaccio. Prelevare un piccolo campione, mescolare con il blu di tripano e contare le cellule utilizzando una piastra per il conteggio delle cellule del sangue.
- Determinare la percentuale di cellule P14 (vive/morte-CD45.1+CD8+Vα2+) mediante citometria a flusso. Assicurarsi che le cellule donatrici trasferite presentino un marcatore congenico distinto con i topi riceventi (i topi B6 portatori di tumore sono CD45.2+). Eseguire la colorazione prima del trasferimento per verificare il corretto fenotipo delle cellule trasferite.
- Aggiungere 5 x 104- 1 x 105 cellule a una provetta da centrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di tampone FACS. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g a 4 °C per 3 min.
- Scartare il surnatante, muovere il fondo della provetta per disperdere le cellule e posizionare la provetta sul ghiaccio.
- Preparare la seguente miscela di anticorpi coniugati 9,32 diluita in 100 μL di tampone FACS: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Macchia viva/morta, 1:400. (Tabella dei materiali).
- Centrifugare la miscela di anticorpi a 15.000 x g per 3 minuti per aggregare le particelle. Mettere il composto sul ghiaccio e proteggerlo dalla luce avvolgendolo in un foglio. Assumere solo il surnatante per evitare l'aspirazione di particelle.
- Risospendere le cellule in 100 μL della miscela di anticorpi e mescolare accuratamente scuotendo la parete della provetta. Dopo aver avvolto in carta stagnola, incubare la provetta per 30 minuti su ghiaccio.
- Lavare le celle 2 volte con tampone FACS. Centrifugare la provetta a 500 x g a 4 °C per 3 min. Risospendere le cellule con 200 μL di tampone FACS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di flusso.
- Eseguire il tubo di flusso con le cellule colorate su un citometro a flusso per determinare la percentuale di cellule CD45.1+CD8+Vα2+ vive/morte.
NOTA: Generalmente, oltre il 90% delle cellule T CD8+ di topi transgenici P14 ospitava Vα2+TCR, che sono specifici per l'epitopo H-2Db GP33-41 di LCMV (virus della coriomeningite linfocitica).
- Calcolare il numero assoluto di cellule vive/morte-CD45.1+CD8+Vα2+ moltiplicando la sua percentuale e il numero di cellule vive ottenute nei passaggi 4.2 e 4.3.
- Aspirare 200 μL di sospensione di cellule P14 (5 x 105 cellule) con una siringa da insulina da 100 U e rimuovere le bolle. Il numero iniziale di cellule P14 naive trasferite (5 x 103 - 5 x 105) non ha influenzato il fenotipo delle cellule trasferite9.
- Metti i topi in una gabbia e scalda con una lampada a infrarossi per 5-10 minuti per espandere la vena caudale. Tenere in posizione con un fissatore per topi di dimensioni adeguate, raddrizzare la coda e pulirla con un batuffolo di cotone contenente il 75% di etanolo per rendere visibili le vene.
- Inserire l'ago parallelamente alla vena caudale e tirare delicatamente indietro lo stantuffo. Se c'è sangue che scorre nella siringa, spingere lentamente la sospensione cellulare nella vena.
NOTA: Se c'è resistenza o gonfiore della coda durante l'iniezione, la posizione di iniezione deve essere regolata. Il sito di iniezione deve iniziare all'estremità distale. - Al termine dell'iniezione, estragga rapidamente l'ago e prema delicatamente il sito di iniezione con un batuffolo di cotone. Rimetti il mouse in una nuova gabbia pulita e osservalo attentamente per diversi minuti per eventuali effetti negativi.
5. Resezione del tumore primitivo
NOTA: Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Sterilizzare l'area operatoria all'interno della cabina di biosicurezza con etanolo al 75%, seguita da irradiazione UV per almeno 30 min. Indossare camici, cappelli, maschere e guanti sterili puliti durante l'intervento chirurgico.
- Quando il tumore è palpabile (circa 5 mm di diametro), resecare il tumore primario.
- Anestetizzare i topi con iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg/kg). Pinch foot pad per valutare il grado di anestesia, se non c'è riflesso del dolore, indica il momento giusto per l'intervento. Se gli arti posteriori sono stati ritirati, fornire un'altra dose di 10-30 μL.
NOTA: In alternativa, medetomidina intraperitoneale (1 mg/kg di peso corporeo; Domitor) è consigliato per anestetizzare i topi. - Applicare l'unguento preventivo essiccante sugli occhi del topo. Rimuovere il pelo sull'addome con una crema depilatoria per esporre completamente il campo operatorio.
- Posizionare il topo in una cabina di biosicurezza e posizionarlo su una tavola anatomica ricoperta di carta assorbente pulita in posizione supina in modo che l'asse longitudinale del topo sia parallelo allo sperimentatore.
NOTA: Per mantenere un ambiente sterile rigoroso, le seguenti procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza. - Disinfettare l'addome dei topi con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio povidone. Incidere la pelle vicino al sito del tumore con un bisturi sterile o forbici oftalmiche. Inserire la punta delle forbici chiusa nell'incisione per esporre chiaramente il tumore. Quando si incide la pelle, assicurarsi di non danneggiare i linfonodi inguinali.
- Durante la rimozione del tumore, mantenere la capsula il più intatta possibile. Rimuovere con cura e delicatezza il tessuto connettivo adiacente al tumore con forbici sterili. Rimuovere completamente il tumore in situ , altrimenti potrebbe ripresentarsi.
6. Iniezione intranodale di cellule B16F10-GP nel linfonodo inguinale
NOTA: Dopo l'eliminazione bilaterale del tumore, le cellule B16F10-GP sono state iniettate nel linfonodo inguinale unilaterale e il PBS è stato iniettato nell'altro lato.
- Aspirare 20 μL (5 x 104 cellule) di sospensione cellulare B16F10-GP con una siringa da insulina da 100 U, rimuovere le bolle e quindi iniettare in un linfonodo inguinale. Iniettare un volume uguale di PBS nel linfonodo inguinale sull'altro lato.
- Durante l'iniezione, inserire l'ago dall'estremità distale del linfonodo, quindi inserire lentamente l'ago al centro del linfonodo. A questo punto, se il fluido viene iniettato con precisione nel linfonodo, il linfonodo può essere visto gonfiarsi in modo significativo.
NOTA: Quando l'ago viene inserito dall'estremità distale del linfonodo, assicurarsi di non perforare il linfonodo.
- Durante l'iniezione, inserire l'ago dall'estremità distale del linfonodo, quindi inserire lentamente l'ago al centro del linfonodo. A questo punto, se il fluido viene iniettato con precisione nel linfonodo, il linfonodo può essere visto gonfiarsi in modo significativo.
- Suturare l'incisione con 2-3 punti di sutura utilizzando una sutura 3-0. Disinfettare la pelle che circonda la ferita con cotone impregnato di iodio povidone. Fare attenzione a bypassare i linfonodi durante la sutura.
- Posizionare il mouse in una gabbia pulita e tenerlo al caldo utilizzando la luce infrarossa nella posizione di decubito laterale. Monitorare continuamente fino a quando non viene recuperata conoscenza. Assicurarsi che i topi che hanno subito un intervento chirurgico non vengano restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.
- Somministrare buprenorfina ogni 4-6 ore per 3 giorni consecutivi dopo l'operazione per alleviare il dolore postoperatorio (alla dose di 0,1-0,5 mg/kg, SQ o IP). Monitora le aree di alimentazione, bere, movimento e attività dei topi. In genere, i topi si riprendono dal trauma chirurgico entro 3 giorni.
NOTA: Se i topi non sono in grado di riprendere la normale alimentazione e attività e mostrano segni di infezione, consultare un veterinario per un intervento o sopprimerlo. - Sacrificare i topi in diversi momenti: giorno 8 e giorno 18 dopo l'iniezione intranodale di cellule tumorali. Recupera le cellule attivate del donatore utilizzando l'analisi della citometria a flusso.
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Representative Results
Il diagramma schematico di questo disegno sperimentale è mostrato nella Figura 1A. Un totale di 5 x 105 cellule B16F10-GP in 100 μL di PBS sono state impiantate per via sottocutanea (s.c.) nella regione inguinale bilaterale di topi CD45.2 C57BL/6J. Dopo 7 giorni, a questi topi portatori di tumore è stata iniettata per via intraperitoneale (i.p.) 4 mg di CTX, seguita dal trasferimento adottivo di 5 x 105 cellule CD45.1+P14 attraverso l'iniezione endovenosa (e.v.) della coda. Quando i tumori sono cresciuti fino a circa 3-5 mm di diametro (circa 7 giorni dopo il trasferimento delle cellule P14), i tumori primari sono stati resecati e 5 x 104 cellule B16F10-GP in 20 μL di PBS sono state iniettate direttamente nel linfonodo inguinale unilaterale. Il linfonodo inguinale sull'altro lato è stato iniettato con volumi uguali di PBS. La colorazione rappresentativa dell'ematossilina e dell'eosina (H&E, 100x) del linfonodo non metastatico (nLN) e del linfonodo metastatico (mLN) nei punti temporali indicati è mostrata nella Figura 1B. La struttura di nLN era intatta. Nella fase iniziale della metastasi dei LN (D8), l'mLN era parzialmente occupato da cellule tumorali (freccia nera) e c'è ancora un po' di area residua con linfociti che non sono stati invasi dalle cellule tumorali (freccia rossa). Mentre nella fase avanzata della metastasi del LN (D18), il mLN è pieno di cellule tumorali accompagnate da angiogenesi tumorale e piccoli linfociti. Le cellule P14 attivate recuperate in TdLN hanno prodotto alti livelli di IFN-γ dopo stimolazione del peptide GP33-41 9,31. Qui, le percentuali di cellule P14 attivate sono state analizzate attraverso la citometria a flusso in diversi punti temporali e la strategia di gating è mostrata nella Figura 2. La frequenza delle cellule T CD8+ antigene-specifiche nel sangue periferico in fase iniziale (D8) e tardiva (D18) è rispettivamente del 2,81% e dell'1,48% (Figura 3A). È stato riportato che le cellule T CD8+ specifiche per il tumore risiedono strettamente nel dLN durante la tumorigenesi e che le cellule del donatore non drenanti hanno recuperato cellule limitate del donatore33. La percentuale di cellule P14 antigene-specifiche in nLN è rimasta stabile durante le metastasi di LN. Curiosamente, le cellule T CD8+ antigene-specifiche in mLN sono state potenziate transitoriamente nella fase iniziale, evidenziata dalla maggiore frequenza delle cellule P14 rispetto alle nLN, mentre è diminuita bruscamente nella fase avanzata (Figura 3B).
Figura 1: Diagramma schematico del disegno sperimentale. (A) I topi C57BL/6J (CD45.2+) vengono impiantati con 5 x 105 cellule tumorali B16F10-GP sulla regione inguinale bilaterale. Dopo 7 giorni, questi topi vengono iniettati per via intraperitoneale con 4 mg di CTX e seguiti dal trasferimento adottivo di diverse cellule P14 marcate congenemente (CD45.1+) il giorno successivo. Quando i tumori crescono fino a circa 3-5 mm di diametro (circa 7 giorni dopo il trasferimento delle cellule P14), i tumori primari vengono resecati, quindi 5 x 104 cellule B16F10-GP in 20 μL di PBS vengono iniettate direttamente nel linfonodo inguinale unilaterale e il linfonodo inguinale sull'altro lato viene iniettato con volumi uguali di PBS. (B) Colorazione rappresentativa dell'ematossilina e dell'eosina (H&E,100x) dei LN. Abbreviazioni: s.c. = sottocutaneo; CTX= ciclofosfamide; i.v. = per via endovenosa; Sac = sacrificio; nLN = LN non metastatico; mLN = LN metastatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating per l'analisi della citometria a flusso. Strategia di gating utilizzata per identificare le cellule T CD8+ specifiche dell'antigene attivato derivate dal donatore. Abbreviazioni: L/D = vivo/morto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dinamica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche durante le metastasi dei LN. La proporzione di cellule T CD8+ antigene-specifiche in (A) sangue periferico, (B) nLN e mLN in diversi punti temporali. Abbreviazioni: nLN = LN non metastatico; mLN = LN metastatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Durante la tumorigenesi, le cellule presentanti l'antigene (APC) inghiottono gli antigeni tumorali e migrano verso TdLN dove innescano le cellule T CD8+. Dopo l'innesco e l'attivazione, le cellule T CD8+ lasciano il TdLN e si infiltrano nel tumore per uccidere le cellule tumorali10. Attraverso la resezione di TdLN e la somministrazione di FTY720 che bloccano l'uscita delle cellule immunitarie dagli organi linfoidi, diversi studi hanno dimostrato il ruolo fondamentale di TdLN nel garantire l'efficacia della terapia con checkpoint PD-1/PD-L134,35. Coerentemente con questo, abbiamo recentemente scoperto che le cellule T CD8+ di memoria tumore-specifiche (TTSM) risiedono prevalentemente in TdLN, queste cellule TdLN-TTSM fungono da risposte in buona fede all'ICB9. Sfortunatamente, diversi tipi di cellule tumorali spesso si diffondono ai TdLN dai siti tumorali primari, il che porta alla riconferma strutturale e alla disfunzione delle cellule immunitarie nei TdLN. La ridotta quantità e qualità delle cellule T CD8+ nei mLN è già stata descritta20,36. Tuttavia, i cambiamenti dinamici delle cellule T CD8+, in particolare le cellule T CD8+ specifiche dell'antigene tumorale durante la cascata metastatica dei LN, non sono stati chiariti.
Qui, abbiamo sviluppato un modello murino conveniente per monitorare la dinamica delle cellule T CD8+ sistemiche e locali antigene-specifiche durante il processo di metastasi di LN. Le cellule di melanoma B16F10-GP sono state impiantate per via sottocutanea nella regione inguinale bilaterale, seguite da un trasferimento adottivo con cellule P14 che potrebbero essere attivate in modo specifico dal peptide GP33-41 derivato da GP. Al giorno 7 dopo il trasferimento cellulare, quando le cellule P14 nei LN inguinali erano completamente attivate, i tumori primari in entrambi i lati sono stati resecati e le cellule B16F10-GP sono state iniettate direttamente nei LN inguinali unilaterali, l'operazione simulata sull'altro lato è stata eseguita attraverso l'iniezione con volumi uguali di PBS. Questo ingegnoso design consente il confronto delle cellule P14 in mLN e LN non metastatico (nLN) all'interno degli stessi topi. Allo stesso tempo, le cellule P14 nel sangue periferico all'interno degli stessi topi sono state rilevate in diversi punti temporali durante le metastasi di LN sanguinando la vena orbitale. A parte le frequenze delle cellule P14 nel sangue periferico e dei TdLN in diversi stadi durante le metastasi dei LN, le proprietà trascrizionali ed epigenetiche di queste cellule T CD8+ antigene-specifiche potrebbero essere ulteriormente esaminate con altre tecniche.
Da notare che diversi passaggi devono essere eseguiti con cautela. In primo luogo, i tumori primari dovrebbero essere asportati accuratamente, poiché le cellule tumorali residue ricrescerebbero rapidamente. In secondo luogo, l'operazione deve essere eseguita delicatamente, poiché i tessuti tumorali contengono abbondanti nuovi vasi sanguigni che di solito vengono inevitabilmente rotti durante la resezione del tumore primario e portano alla morte dei topi chirurgici a causa di una massiccia emorragia. Pertanto, la tempistica della resezione del tumore primario è di fondamentale importanza. Generalmente, è relativamente sicuro rimuoverlo quando il tumore raggiunge le dimensioni di circa 5 x 5 mm e le cellule tumorali devono essere iniettate con precisione nel LN piuttosto che nel fondo o nei tessuti adiacenti. Inoltre, il volume delle sospensioni delle cellule tumorali deve essere controllato al di sotto di 20 μL, altrimenti la fuoriuscita formerebbe un nuovo tumore al di fuori del LN. Infine, un limite di questo protocollo è che l'operazione è traumatica e i topi possono subire infezioni durante il processo di guarigione, il che influenzerebbe le proprietà delle cellule T CD8+ antigene-specifiche. Pertanto, è di fondamentale importanza mantenere una rigorosa asepsi durante l'intervento chirurgico e l'iniezione di PBS operata fittiziamente deve essere eseguita per escludere l'impatto del danno fisico indotto dall'iniezione alle cellule T CD8+ antigene-specifiche.
Nel complesso, forniamo un modello conveniente per studiare le cellule T CD8+ antigene-specifiche durante le metastasi dei LN e potrebbero anche essere chiarite le interazioni tra le cellule T CD8+ antigene-specifiche e altre cellule immunitarie o cellule dello stroma durante le metastasi dei LN. Inoltre, potrebbe essere facilmente esteso a molti altri modelli di tumore. Nel complesso, questo protocollo offre un utile modello riproduttivo per lo studio dell'immunologia del cancro.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (n. 82122028 a LX), dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82173094 a LX), dalla Natural Science Foundation di Chong Qing (n. 2023NSCQ-BHX0087 a SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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