Summary
Le plan expérimental présenté ici fournit un modèle de reproduction utile pour les études des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène au cours des métastases ganglionnaires (LN), ce qui exclut la perturbation des lymphocytes T CD8+ témoins.
Abstract
Les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène tumoral provenant des ganglions lymphatiques drainants gagnent en importance dans l’augmentation de la réponse immunitaire antitumorale au cours de la tumorigenèse. Cependant, dans de nombreux cas, les cellules cancéreuses forment des loci métastatiques dans les ganglions lymphatiques avant de métastaser davantage dans des organes distants. On ne sait pas dans quelle mesure les réponses locales et systématiques des lymphocytes T CD8+ ont été influencées par les métastases de LN. À cette fin, nous avons mis en place un modèle murin de métastases LN combiné à une lignée cellulaire de mélanome B16F10-GP exprimant le néoantigène de substitution dérivé du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), la glycoprotéine (GP) et les souris transgéniques P14 hébergeant des récepteurs de lymphocytes T (TCR) spécifiques au peptide GP dérivé de la GP33-41 présenté par la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I H-2Db. Ce protocole permet d’étudier les réponses des lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène au cours des métastases de LN. Dans ce protocole, des souris C57BL/6J ont été implantées par voie sous-cutanée avec des cellules B16F10-GP, suivies d’un transfert adoptif avec des cellules P14 naïves. Lorsque la tumeur sous-cutanée atteignait environ 5 mm de diamètre, la tumeur primaire était excisée et les cellules B16F10-GP étaient directement injectées dans le ganglion lymphatique drainant la tumeur (TdLN). Ensuite, la dynamique des lymphocytes T CD8+ a été surveillée pendant le processus de métastase de LN. Collectivement, ce modèle a fourni une approche permettant d’étudier avec précision les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène pendant les métastases de LN.
Introduction
L’immunothérapie du cancer, en particulier le blocage des points de contrôle immunitaires (ICB), a révolutionné le traitement du cancer1. L’ICB bloque les immunorécepteurs co-inhibiteurs (tels que-1, Tim-3, LAG-3 et TIGIT), qui sont fortement exprimés dans les lymphocytes T CD8+ épuisés dans le microenvironnement tumoral (TME), ce qui entraîne la revigoration des lymphocytes T CD8+ épuisés2. Compte tenu de l’hétérogénéité des lymphocytes T CD8+ épuisés, l’accumulation de preuves a révélé que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la tumeur dérivés de la périphérie, y compris les ganglions lymphatiques drainants (dLN), mais pas dans les EUT, médient l’efficacité de l’ICB 3,4,5,6,7,8. Récemment, il a été confirmé que les lymphocytes T CD8+ mémoires spécifiques à la tumeur TCF-1+TOX dérivés de TdLN (TdLN-TTSM) étaient les véritables répondeurs aux ICB qui incarnent plusieurs propriétés fonctionnelles des lymphocytes T mémoires conventionnels et pourraient se développer et se différencier en cellules épuisées par la descendance lors du traitement par ICB9. Dans l’ensemble, ces résultats ont corroboré l’importance de LN dans le renforcement de l’immunité antitumorale.
Les ganglions lymphatiques fonctionnent comme un endroit critique pour faciliter l’amorçage et l’activation des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la tumeur en fournissant une base structurelle ainsi que des signaux biologiques10. Plusieurs types de cellules cancéreuses ensemencent fréquemment le ganglion sentinelle (SLN, le premier LN drainant une tumeur primaire) avant une dissémination systématique11. La présence de métastases SLN est liée à un mauvais pronostic dans le cancer humain et les modèles précliniques ont montré que les cellules tumorales du TdLN pouvaient se propager à des organes distants à la fois par les vaisseaux lymphatiques et les vaisseaux sanguins du ganglion 12,13,14,15. La biopsie SLN représente désormais une procédure standard pour guider les décisions de traitement ultérieures dans de nombreux types de tumeurs solides, ce qui pourrait éviter une résection inutile de LN16,17 non impliquée. Même pour les LN concernés, la question de savoir si et quand une résection chirurgicale est nécessaire reste controversée, car plusieurs études ont démontré que l’ablation de LN régionale n’a pas amélioré la survie globale par rapport à ceux qui ont reçu une radiothérapie ou une thérapie systémique sans résection régionaleLN 18,19. Une interprétation est que le LN métastatique (mLN) avec une maladie microscopique peut conserver une certaine capacité à éduquer les cellules immunitaires et à fournir certains avantages thérapeutiques. Il est donc extrêmement important d’élucider comment les métastases LN affectent la réponse immunitaire anti-tumorale, en particulier les propriétés et les fonctions de TdLN-TTSM.
Jusqu’à présent, les données précliniques et cliniques ont révélé certaines altérations structurelles et cellulaires du mLN20. Cependant, les changements dynamiques des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la tumeur au cours des métastases LN n’ont pas été délimités. Par conséquent, le développement d’un modèle convaincant de métastases LN est nécessaire pour une étude plus approfondie. En effet, plusieurs études ont rapporté des modèles murins de mLN de différentes manières 14,21,22. Par exemple, des métastases spontanées dans les LN axillaires ont été conduites par l’implantation de cellules cancéreuses du sein 4T1 dans le coussinet adipeux mammaire22. Dans une autre étude, Reticker-Flynn et al. ont généré des lignées cellulaires de mélanome avec une incidence élevée de propagation de la tumeur primaire sous-cutanée aux LN par inoculation en série de cellules tumorales cultivées à partir de tissus mLN dissociés (neuf tours)14. Un autre modèle couramment utilisé a été préparé par l’injection de cellules tumorales dans le coussinet plantaire et les loci métastatiques seraient formés dans le LN22 poplité. Notamment, il est difficile d’évaluer les moments précis de l’intervention car les métastases LN dans ces modèles ne sont pas toujours fidèles.
Dans la présente étude, un modèle métastatique murin de LN a été établi par injection intraganglionnaire de cellules B16F10-GP23,24, générées par l’insertion médiée par CRISPR/Cas9 de la séquence du gène de la glycoprotéine (GP) du virus LCMV dans le génome de la lignée cellulaire 9 de B16F10. Ensuite, ces souris ont été transférées avec des cellules P14 qui hébergent des récepteurs de lymphocytes T transgéniques (TCR) reconnaissent spécifiquement l’épitope H-2Db GP33-41 25,26 et la dynamique systémique et locale des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène pendant les métastases LN a pu être étudiée. Notre conception expérimentale fournit un modèle utile pour l’étude des réponses immunitaires, en particulier des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène pendant la métastase LN, ce qui exclut la perturbation des lymphocytes T CD8+ témoins. Ces résultats affecteraient les options de traitement clinique de l’élimination ou de la conservation du LNm et jetteraient un nouvel éclairage sur la manipulation du LNm pour obtenir des avantages thérapeutiques maximaux.
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Protocol
Les souris C57BL/6J (appelées souris B6) et les souris transgéniques naïves P14 9,27 utilisées étaient âgées de 6 à 10 semaines et pesaient de 18 à 22 g. Les hommes et les femmes ont été inclus sans randomisation ni mise en aveugle. Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université agricole de Qingdao.
1. Préparation du milieu et des réactifs
- Préparez le milieu de culture cellulaire de mélanome B16F10-GP, nommé D10 (milieu DMEM complet) en ajoutant du DMEM, 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de L-glutamine et 100 U/mL supplémentaires de puromycine. Conservez un D10 stérile et conservez-le jusqu’à 2 semaines à une température de 2 à 4 °C.
- Préparez le milieu R2 (pour mettre fin à la lyse des globules rouges) en ajoutant du RPMI-1640 avec 2 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de L-glutamine.
- Préparez un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en ajoutant 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 2 % de FBS et 0,01 % d’azoture de sodium. L’ajout d’azoture de sodium peut prolonger la durée de stockage du tampon FACS, qui peut être stocké pendant des mois à 2-4 ° C.
- Préparez le tampon de lyse des globules rouges (RBL) en ajoutant 155 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3 et 0,1 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) dans de l’eau doublement distillée et ajustez son pH à 7,3. Conservez le tampon RBL à température ambiante (RT) et il reste stable jusqu’à 3 mois.
- Préparez l’anesthésique, le 2,2,2-tribromoéthanol, comme décrit ci-dessous.
- Peser la quantité appropriée de cristaux de 2,2,2-tribromoéthanol dans un tube conique stérile de 50 mL enveloppé de papier d’aluminium. Ajouter une quantité appropriée de 2-méthyl-2-butanol dans le cristal pour préparer la solution mère à la concentration de 500 mg/mL.
- Agitez-le pour mélanger et réchauffer le tube dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que le cristal soit dissous. Assurez-vous que tous les cristaux sont dissous.
- Bien mélanger la solution. Filtrer la solution mère avec un filtre de 0,22 μm dans un récipient stérile. Conserver la solution mère congelée, à l’abri de la lumière, à -20 °C ou diluée avec du PBS dans une solution de travail à la concentration de 12,5 mg/mL et conservée à 4 °C.
REMARQUE : Il est préférable d’utiliser la concentration prescrite car des concentrations plus élevées du liquide sont irritantes.
2. Préparation de la suspension cellulaire B16F10-GP
- Décongeler et cultiver un flacon de 1 x 106 cellules B16F10-GP avec 5 mL de D10 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2. Cellules de sous-culture lorsqu’elles ont atteint une densité de 80 % à 90 % comme décrit ci-dessous.
- Jeter le milieu de culture d’origine par aspiration avec un pistolet de pipetage et laver les cellules 2x avec du PBS. Lorsque vous nettoyez des cellules adhérentes avec du PBS dans une boîte de culture cellulaire, déplacez le PBS vers la paroi latérale ou déposez-le dans la boîte.
- Après l’aspiration du PBS, ajouter 0,5 à 1 mL de solution de trypsine EDTA à 0,25 % dans la boîte ou le ballon de culture cellulaire. Agitez doucement pour couvrir toute la surface de la cellule. Placer la boîte ou le ballon de culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C pendant environ 1 minute ou à RT jusqu’à ce que les cellules soient arrondies et séparées. Observez l’exfoliation des cellules à l’aide d’un microscope inversé.
- Ajouter un volume égal de D10 fraîchement formulé pour terminer la digestion de la trypsine. Purger la surface inférieure du ballon de culture cellulaire avec un pistolet de pipetage pour s’assurer que toutes les cellules ont été séparées.
- Transférer la suspension cellulaire B16F10-GP dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 163 x g pendant 4 min à RT.
- Aspirer le surnageant et le jeter. Remettre les cellules en suspension dans 1 à 2 mL de D10 pour les précipitations. Transférer la suspension cellulaire B16F10-GP dans une nouvelle boîte de culture cellulaire ou un nouveau flacon contenant 8 à 10 mL de D10, puis incuber dans un incubateur cellulaire à 37 °C à 5 % de CO2.
- Le jour de l’implantation de la tumeur, prélevez des cellules B16F10-GP d’une densité d’environ 90 %, comme décrit aux étapes 2.1.1 à 2.1.4. Après centrifugation, aspirer le surnageant et le jeter. Remettre le précipité cellulaire en suspension dans 1 mL de PBS.
- Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre bleu trypan à 0,4 %. Ajouter du PBS pour diluer la cellule à 5 x 105 cellules par 100 μL. Placer les cellules sur de la glace jusqu’à utilisation.
3. Inoculation ectopique de cellules B16F10-GP dans la région inguinale bilatérale de souris
- Aspirer 100 μL de suspension cellulaire préparée de B16F10-GP à l’aide d’une seringue de 1 mL. Effleurez la paroi du tube pour déplacer les bulles vers le haut et poussez le piston pour déplacer la bulle supérieure.
- Tenez la souris en position couchée, exposant son abdomen. Appuyez sur le membre postérieur droit de la souris en position couchée avec un doigt afin que la peau de la région inguinale droite soit complètement exposée (idem pour la région inguinale gauche).
- Retirez la fourrure de l’abdomen avec de la crème dépilatoire, puis nettoyez la zone bilatérale de l’abdomen avec du coton contenant 75% d’éthanol.
- Avant d’insérer l’aiguille, assurez-vous que la peau de la région inguinale est bien tendue. Insérez l’aiguille à un angle de 45° dans l’espace sous-cutané de la région inguinale du haut de la cuisse. Assurez-vous que l’aiguille est biseautée vers le haut et que la profondeur de l’aiguille est de 0,5 à 1 cm.
- Appliquer une aspiration douce avant l’injection, s’il n’y a pas de sang, injecter lentement les cellules injectées dans le tissu sous-cutané. En même temps, observez un petit bolus (formation d’une poche de liquide) dans la région sous-cutanée.
- Après l’injection, retirez l’aiguille, mettez-la dans la boîte à objets tranchants et remettez la souris dans sa cage.
4. Transfert adoptif de lymphocytes T P14 chez des souris porteuses de tumeurs
- Effectuer un transfert adoptif chez les souris porteuses de tumeurs 6 à 8 jours après l’implantation de la tumeur, lorsque les tumeurs sont palpables (environ 3 à 5 mm de diamètre). Injecter par voie intrapéritonéale 4 mg de cyclophosphamide la veille du transfert 28,29,30.
REMARQUE : L’objectif de l’injection de CTX est de créer de l’espace dans le compartiment lymphatique pour les lymphocytes T transférés par adoption en éliminant transitoirement les lymphocytes proliférants. - Isoler les lymphocytes de la rate et des LN de souris transgéniques P14 naïves comme décrit ci-dessous31,32 (6-10 semaines, du même sexe que les souris porteuses de tumeurs pour éviter les problèmes de rejet).
REMARQUE : Effectuer les procédures suivantes dans une enceinte de sécurité biologique pour assurer des conditions strictement stériles.- Préparez deux plats de 6 cm et ajoutez 3 ml de R2 medium à l’un des plats et 3 ml de tampon RBL à l’autre plat. Placez un filtre cellulaire de 70 μm dans la boîte de Pétri contenant le tampon RBL.
- Euthanasier les souris P14 dans des contenants hermétiques contenant de l’isoflurane suivi d’une luxation cervicale. Ajustez le nombre de souris P14 en fonction du nombre de souris receveuses.
- Prélevez les ganglions lymphatiques de la rate, de l’inguinal et de l’axillaire des souris euthanasiées et transférez-les dans des boîtes de 6 cm contenant 4 ml de milieu R2 et placées sur de la glace.
- Placez la rate dans une passoire imbibée de 3 mL de tampon RBL, broyez la rate avec le putter à l’intérieur de la seringue de 1 mL. Incuber les cellules à RT pendant 1 à 2 minutes, puis terminer la réaction avec 3 mL de milieu R2 froid.
- Broyer les LN avec le putter à l’intérieur de la seringue de 1 mL jusqu’à ce qu’il ne reste que du tissu conjonctif dans la crépine avec un filtre à cellules de 70 μm. Rincez le filtre avec un milieu R2 froid et transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger les échantillons à 500 x g pendant 6 min à 4 °C.
- Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 3 mL de PBS. Utilisez un filtre cellulaire de 70 μm pour éliminer le matériau floculant de la suspension cellulaire.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 6 min à 4 °C. Remettez les cellules en suspension avec 3 ml de PBS et placez le tube sur de la glace. Prélevez un petit échantillon, mélangez-le avec du bleu trypan et comptez les cellules à l’aide d’une plaque de comptage des cellules sanguines.
- Déterminer le pourcentage de cellules P14 (CD45.1+CD8+Vα2+) par cytométrie en flux. Assurez-vous que les cellules du donneur transférées présentent un marqueur congénique distinct avec les souris receveuses (les souris B6 porteuses de tumeurs sont CD45.2+). Effectuez une coloration avant le transfert pour vérifier le phénotype correct des cellules transférées.
- Ajouter 5 x 104- 1 x 105 cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 mL contenant 1 mL de tampon FACS. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g à 4 °C pendant 3 min.
- Jetez le surnageant, effleurez le fond du tube pour disperser les cellules et placez le tube sur de la glace.
- Préparer le mélange d’anticorps conjugués suivant 9,32 dilué dans 100 μL de tampon FACS : anti-CD8, 1:200 ; anti-TCR Vα2, 1:100 ; anti-CD45.1, 1:200 ; Tache vivante/morte, 1:400. (Tableau des matériaux).
- Centrifuger le mélange d’anticorps à 15 000 x g pendant 3 min pour agréger les particules. Placez le mélange sur de la glace et protégez-le de la lumière en l’enveloppant dans du papier d’aluminium. Ne prenez que le surnageant pour éviter l’aspiration de particules.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μL du mélange d’anticorps et bien mélanger en effleurant la paroi du tube. Après l’avoir enveloppé dans du papier d’aluminium, incuber le tube pendant 30 min sur de la glace.
- Lavez les cellules 2x avec un tampon FACS. Centrifuger le tube à 500 x g à 4 °C pendant 3 min. Remettre les cellules en suspension avec 200 μL de tampon FACS et transférer la suspension cellulaire dans un tube d’écoulement.
- Faites passer le tube d’écoulement avec les cellules colorées sur un cytomètre en flux pour déterminer le pourcentage de cellules CD45.1+CD8+Vα2+ vivantes/mortes.
REMARQUE : En général, plus de 90 % des lymphocytes T CD8+ des souris transgéniques P14 hébergeaient des TCR Vα2+, qui sont spécifiques de l’épitope H-2Db GP33-41 du LCMV (virus de la chorioméningite lymphocytaire).
- Calculer le nombre absolu de cellules CD45.1+CD8+Vα2+ vivantes/mortes en multipliant son pourcentage par le nombre de cellules vivantes obtenu aux étapes 4.2 et 4.3.
- Aspirer 200 μL de suspension de cellules P14 (5 x 105 cellules) avec une seringue à insuline de 100 U et éliminer les bulles. Le nombre initial de cellules P14 naïves transférées (5 x 103 - 5 x 105) n’a pas affecté le phénotype des cellules transférées9.
- Placez les souris dans une cage et réchauffez-les avec une lampe infrarouge pendant 5 à 10 minutes pour élargir la veine de la queue. Maintenez en place avec un fixateur de souris de taille appropriée, redressez la queue et essuyez-la avec une boule de coton contenant 75% d’éthanol pour rendre les veines visibles.
- Insérez l’aiguille parallèlement à la veine de la queue et tirez doucement le piston vers l’arrière. S’il y a du sang qui circule dans la seringue, poussez lentement la suspension cellulaire dans la veine.
REMARQUE : S’il y a une résistance ou un gonflement de la queue pendant l’injection, la position d’injection doit être ajustée. Le site d’injection doit commencer à l’extrémité distale. - Une fois l’injection terminée, retirez rapidement l’aiguille et appuyez doucement sur le site d’injection avec une boule de coton. Remettez la souris dans une nouvelle cage propre et observez-la attentivement pendant plusieurs minutes pour détecter tout effet indésirable.
5. Résection de la tumeur primitive
REMARQUE : Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont autoclavés avant utilisation. Stériliser la zone opératoire à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité avec de l’éthanol à 75 %, puis irradier aux UV pendant au moins 30 min. Portez des blouses, des chapeaux, des masques et des gants stériles propres pendant la chirurgie.
- Lorsque la tumeur est palpable (environ 5 mm de diamètre), réséquez la tumeur primaire.
- Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (75 mg/kg). Pincez le coussinet pour évaluer le degré d’anesthésie, s’il n’y a pas de réflexe de douleur, cela indique le bon moment pour la chirurgie. Si les membres postérieurs ont été retirés, fournir une autre dose de 10 à 30 μL.
REMARQUE : Alternativement, la médétomidine intrapéritonéale (1 mg/kg de poids corporel ; Domitor) est recommandé pour anesthésier les souris. - Appliquez la pommade préventive asséchante sur les yeux de souris. Retirez la fourrure de l’abdomen avec de la crème dépilatoire pour exposer complètement le champ opératoire.
- Placez la souris dans une enceinte de biosécurité et placez-la sur une planche anatomique recouverte de papier absorbant propre en position couchée de manière à ce que l’axe longitudinal de la souris soit parallèle à l’expérimentateur.
REMARQUE : Pour maintenir un environnement strictement stérile, les procédures suivantes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. - Désinfectez l’abdomen des souris avec une boule de coton imbibée de povidone iodée. Incisez la peau près du site porteur de la tumeur avec un scalpel stérile ou des ciseaux ophtalmiques. Insérez la pointe des ciseaux fermée dans l’incision pour exposer clairement la tumeur. Lors de l’incision de la peau, assurez-vous de ne pas endommager les ganglions lymphatiques inguinaux.
- Lors de l’ablation de la tumeur, gardez la capsule aussi intacte que possible. Retirez soigneusement et doucement le tissu conjonctif adjacent à la tumeur avec des ciseaux stériles. Enlevez complètement la tumeur in situ , sinon elle risque de récidiver.
6. Injection intraganglionnaire de cellules B16F10-GP dans le ganglion lymphatique inguinal
REMARQUE : Après l’élimination bilatérale de la tumeur, les cellules B16F10-GP ont été injectées dans le ganglion lymphatique inguinal unilatéral et le PBS a été injecté dans l’autre côté.
- Aspirer 20 μL (5 x 104 cellules) de suspension de cellules B16F10-GP avec une seringue à insuline de 100 U, retirer les bulles puis injecter dans un ganglion lymphatique inguinal. Injectez un volume égal de PBS dans le ganglion lymphatique inguinal de l’autre côté.
- Pendant l’injection, insérez l’aiguille à partir de l’extrémité distale du ganglion lymphatique, puis insérez lentement l’aiguille au centre du ganglion lymphatique. À ce moment, si le liquide est injecté avec précision dans le ganglion lymphatique, on peut voir le ganglion lymphatique gonfler considérablement.
REMARQUE : Lorsque l’aiguille est insérée à partir de l’extrémité distale du ganglion lymphatique, assurez-vous de ne pas perforer le ganglion.
- Pendant l’injection, insérez l’aiguille à partir de l’extrémité distale du ganglion lymphatique, puis insérez lentement l’aiguille au centre du ganglion lymphatique. À ce moment, si le liquide est injecté avec précision dans le ganglion lymphatique, on peut voir le ganglion lymphatique gonfler considérablement.
- Suturez l’incision avec 2-3 points de suture à l’aide d’une suture 3-0. Désinfectez la peau entourant la plaie avec un coton imprégné de povidone iodée. Prenez soin de contourner les ganglions lymphatiques pendant la suture.
- Placez la souris dans une cage propre et gardez-la au chaud à l’aide de la lumière infrarouge en position de décubitus latéral. Surveiller continuellement jusqu’à ce que la conscience soit rétablie. S’assurer que les souris qui ont subi une intervention chirurgicale ne sont pas renvoyées en compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies.
- Administrer la buprénorphine toutes les 4 à 6 h pendant 3 jours consécutifs après l’opération pour soulager la douleur postopératoire (à une dose de 0,1 à 0,5 mg/kg, QS ou IP). Surveillez les zones d’alimentation, d’abreuvement, de mouvement et d’activité des souris. En règle générale, les souris se remettent d’un traumatisme chirurgical dans les 3 jours.
REMARQUE : Si les souris ne peuvent pas reprendre leur alimentation et leurs activités normales et présentent des signes d’infection, consultez un vétérinaire pour une intervention ou euthanasiez-les. - Sacrifiez des souris à différents moments : jour 8 et jour 18 après injection intraganglionnaire de cellules tumorales. Récupérez les cellules de donneurs activées à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux.
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Representative Results
Le schéma de principe de ce plan expérimental est illustré à la figure 1A. Un total de 5 x 10cellules 5 B16F10-GP dans 100 μL de PBS ont été implantées par voie sous-cutanée (s.c.) dans la région inguinale bilatérale de souris CD45.2 C57BL/6J. Après 7 jours, ces souris porteuses de tumeurs ont reçu une injection intrapéritonéale (i.p.) de 4 mg de CTX, suivie du transfert adoptif de 5 x 105 cellules CD45.1+P14 par injection intraveineuse (i.v.) de queue. Lorsque les tumeurs atteignaient environ 3 à 5 mm de diamètre (environ 7 jours après le transfert des cellules P14), les tumeurs primaires étaient réséquées et 5 x 10 cellules B16F10-GP dans 20 μL de PBS étaient directement injectées dans le ganglion lymphatique inguinal unilatéral. Le ganglion lymphatique inguinal de l’autre côté a été injecté avec des volumes égaux de PBS. La coloration représentative à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E, 100x) du ganglion lymphatique non métastatique (nLN) et du ganglion lymphatique métastatique (mLN) aux points temporels indiqués est illustrée à la figure 1B. La structure de nLN était intacte. Au stade précoce de la métastase LN (D8), le mLN était partiellement occupé par les cellules tumorales (flèche noire), et il reste encore une zone avec des lymphocytes qui n’ont pas été envahis par les cellules tumorales (flèche rouge). Alors qu’au stade avancé de la métastase de LN (D18), le mLN est rempli de cellules tumorales accompagnées d’angiogenèse tumorale et de petits lymphocytes. Les cellules P14 activées récupérées dans le TdLN ont produit un niveau élevé d’IFN-γ après stimulation peptidique GP33-41 9,31. Ici, les pourcentages de cellules P14 activées ont été analysés par cytométrie en flux à différents moments et la stratégie de déclenchement est illustrée à la figure 2. La fréquence des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène dans le sang périphérique au stade précoce (D8) et au stade avancé (D18) est de 2,81 % et 1,48 %, respectivement (Figure 3A). Il a été rapporté que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la tumeur résidaient strictement dans le dLN pendant la tumorigenèse et que les cellules de donneurs limitées non drainantes récupérées par LN33. Le pourcentage de cellules P14 spécifiques de l’antigène dans nLN était stable pendant les métastases de LN. Curieusement, les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène dans mLN ont été temporairement stimulés au stade précoce, comme en témoigne la fréquence plus élevée des cellules P14 par rapport au nLN, alors qu’elle a fortement diminué au stade avancé (Figure 3B).
Figure 1 : Schéma de principe du plan expérimental. (A) Des souris C57BL/6J (CD45.2+) sont implantées avec 5 x 10 cellules tumorales5 B16F10-GP sur la région inguinale bilatérale. Après 7 jours, ces souris reçoivent une injection intrapéritonéale de 4 mg de CTX, suivie du transfert adoptif de différentes cellules P14 marquées congénitalement (CD45.1+) le lendemain. Lorsque les tumeurs atteignent environ 3 à 5 mm de diamètre (environ 7 jours après le transfert des cellules P14), les tumeurs primaires sont réséquées, puis 5 x 10cellules 4 B16F10-GP dans 20 μL de PBS sont directement injectées dans le ganglion lymphatique inguinal unilatéral, et le ganglion lymphatique inguinal de l’autre côté est injecté avec des volumes égaux de PBS. (B) Coloration représentative à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E,100x) des LNs. Abréviations : s.c. = sous-cutanée ; CTX = cyclophosphamide ; i.v. = intraveineuse ; Sac = sacrifice ; nLN = LN non métastatique ; mLN = LN métastatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie de déclenchement pour l’analyse par cytométrie en flux. Stratégie de contrôle utilisée pour identifier les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène activé dérivés du donneur. Abréviations : L/D = vivant/mort. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dynamique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène au cours des métastases de LN. Proportion de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène dans (A) le sang périphérique, (B) nLN et mLN à différents moments. Abréviations : nLN = LN non métastatique ; mLN = LN métastatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Au cours de la tumorigenèse, les cellules présentatrices d’antigènes (APC) engloutissent les antigènes tumoraux et migrent vers le TdLN où elles amorcent les lymphocytes T CD8+. Après amorçage et activation, les lymphocytes T CD8+ quittent le TdLN et s’infiltrent dans la tumeur pour tuer les cellules tumorales10. Grâce à la résection du TdLN et à l’administration de FTY720 qui bloquent la sortie des cellules immunitaires des organes lymphoïdes, plusieurs études ont démontré le rôle central du TdLN dans l’efficacité du traitement par point de contrôle-1/-L134,35. En accord avec cela, nous avons récemment découvert que les lymphocytes T CD8+ mémoires spécifiques à la tumeur (TTSM) résident principalement dans TdLN, ces cellulesTdLN-T TSM servent de véritables répondeurs à ICB9. Malheureusement, plusieurs types de cellules cancéreuses se propagent souvent aux TdLN à partir des sites tumoraux primaires, ce qui entraîne une reconfirmation structurelle et un dysfonctionnement des cellules immunitaires dans les TdLN. La quantité et la qualité altérées des lymphocytes T CD8+ dans les LNm ont déjà été décrites20,36. Cependant, les changements dynamiques des lymphocytes T CD8+, en particulier les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène tumoral au cours de la cascade métastatique LN, n’ont pas été élucidés.
Ici, nous avons développé un modèle murin pratique pour surveiller la dynamique des lymphocytes T CD8+ systémiques et locaux spécifiques à l’antigène pendant le processus de métastase de LN. Les cellules de mélanome B16F10-GP ont été implantées par voie sous-cutanée dans la région inguinale bilatérale, suivies d’un transfert adoptif avec des cellules P14 qui pourraient être spécifiquement activées par le peptide dérivé de la GPGP 33-41. Au jour 7 après le transfert cellulaire, lorsque les cellules P14 des LN inguinaux étaient complètement activées, que les tumeurs primaires des deux côtés étaient réséquées et que les cellules B16F10-GP étaient directement injectées dans les LN inguinaux unilatéraux, une opération fictive de l’autre côté était réalisée par injection avec des volumes égaux de PBS. Cette conception ingénieuse permet de comparer les cellules P14 dans le LNm et le LN non métastatique (nLN) au sein d’une même souris. Simultanément, les cellules P14 dans le sang périphérique des mêmes souris ont été détectées à différents moments pendant les métastases de LN en saignant la veine orbitaire. Outre les fréquences des cellules P14 dans le sang périphérique et les TdLNs à différents stades des métastases de LN, les propriétés transcriptionnelles et épigénétiques de ces lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène pourraient être examinées plus en détail avec d’autres techniques.
Il convient de noter que plusieurs étapes doivent être effectuées avec prudence. Tout d’abord, les tumeurs primaires doivent être excisées soigneusement, car les cellules tumorales résiduelles se redévelopperaient rapidement. Deuxièmement, l’opération doit être effectuée en douceur, car les tissus tumoraux contiennent de nouveaux vaisseaux sanguins abondants qui sont généralement inévitablement brisés lors de la résection tumorale primaire et entraînent la mort des souris chirurgicales en raison d’une hémorragie massive. Par conséquent, le moment de la résection tumorale primaire est d’une importance cruciale. En général, il est relativement sûr de l’enlever lorsque la tumeur atteint une taille d’environ 5 x 5 mm, et les cellules tumorales doivent être injectées avec précision dans LN plutôt que dans les tissus inférieurs ou adjacents. De plus, le volume des suspensions de cellules tumorales doit être contrôlé en dessous de 20 μL, sinon le déversement formerait une nouvelle tumeur à l’extérieur du LN. Enfin, une limite de ce protocole est que l’opération est traumatisante et que les souris peuvent subir une infection pendant le processus de guérison, ce qui affecterait les propriétés des lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène. Par conséquent, il est extrêmement important de maintenir une asepsie stricte pendant la chirurgie et une injection de PBS opérée simulée doit être effectuée pour exclure l’impact des dommages physiques induits par l’injection sur les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.
Dans l’ensemble, nous fournissons un modèle pratique pour étudier les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène pendant les métastases de LN et les interactions entre les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène et d’autres cellules immunitaires ou stroma pendant les métastases de LN pourraient également être élucidées. De plus, il pourrait être facilement étendu à plusieurs autres modèles tumoraux. Collectivement, ce protocole offre un modèle de reproduction utile pour l’étude de l’immunologie du cancer.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences pour les jeunes chercheurs exceptionnels de Chine (n° 82122028 à LX), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82173094 à LX), la Fondation des sciences naturelles de Chong Qing (n° 2023NSCQ-BHX0087 à SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
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