Summary
本研究では、進行性冠動脈狭窄症による慢性心筋虚血の外科的ブタモデルを提示し、梗塞を伴わずに心機能障害を呈する。虚血後、動物は、幹細胞由来のエキソソームを含むコラーゲンパッチの心外膜留置を伴うオフポンプ冠動脈バイパス移植を受けます。この補助療法は、心筋機能と回復を改善します。
Abstract
進行性冠動脈狭窄症による慢性心筋虚血は、代謝活性を低下させることで酸素利用能の低下に適応する心筋として定義される冬眠心筋(HIB)を引き起こし、それによって不可逆的な心筋細胞の損傷や梗塞を防ぎます。これは心筋梗塞とは異なり、HIBは血行再建術で回復する可能性があります。重篤な冠動脈疾患(CAD)の患者は慢性虚血を経験し、心不全や突然死のリスクにさらされます。重症CADに対する標準的な外科的介入は冠動脈バイパス術(CABG)であるが、これは不完全な治療法であることが示されているが、慢性虚血に適応した筋細胞を回復するための補助療法は存在しない。 このギャップに対処するために、CABGに従順で臨床シナリオを模倣したブタを使用したHIBの外科モデルが使用されました。このモデルには2つの手術が含まれます。最初の手術では、左前下行動脈(LAD)に1.5mmの硬い収縮器を埋め込みます。動物が成長するにつれて、収縮筋は徐々に著しい狭窄を引き起こし、局所収縮機能が低下します。狭窄が80%に達すると、心筋の流れと機能が損なわれ、HIBが発生します。次に、左内乳腺動脈(LIMA)でオフポンプCABGを行い、虚血領域を血行再建します。動物は1ヶ月間回復し、犠牲になる前に最適な心筋の改善を可能にします。これにより、さまざまな治療群の生理学的および組織学的研究が可能になります。この動物モデルは、CABGにもかかわらず心機能が損なわれたままであることを示しており、新しい補助的介入の必要性を示唆しています。本研究では、間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームを包埋したコラーゲンパッチを開発し、LIMA吻合の遠位にある心外膜表面に外科的に適用しました。この材料は心外膜に適合し、吸収性であり、シグナル伝達因子の持続的な放出のための足場を提供します。この再生療法は、血行再建術だけでは反応しない心筋の回復を促すことができます。このモデルは、HIBの回復に関する生理学的およびメカニズム的調査の手段を提供することにより、臨床分野に変換されます。
Introduction
世界的に、重度のCADは1億人以上の患者が罹患しており、死亡率は低下していますが、依然として主要な死因の1つです1,2。CADには、心筋梗塞(MI)から生存率が保たれた虚血まで、幅広い臨床スペクトルがあります。ほとんどの前臨床研究は、小動物モデルと大動物モデルで研究できるため、梗塞組織の存在を特徴とする心筋梗塞に焦点を当てています。ただし、そのモデルは、生存率が維持され、血行再建術に適している患者には対応していません。CABGを受けているほとんどの患者は、収縮予備能と生存率の変動を維持しながら、血液供給が減少し、機能が制限されています3。治療を行わないと、これらの患者は、特に作業負荷の増加時に、進行した心不全や突然死に進行する可能性があります4。これらの患者のうち、冠動脈バイパス術(CABG)は有効な治療法ですが、完全な機能回復には至らない可能性があります5。重要なことに、臨床転帰の悪化のマーカーである拡張期機能障害は、血行再建術後に回復せず、CABG 6,7 中の新しい補助療法の必要性を示唆しています。現在、心筋細胞を完全な機能能力に回復させるためにCABGで使用される臨床的に利用可能な補助介入はありません。これは、適切な血行再建術にもかかわらず、多くの患者が進行性心不全に進行することを考えると、大きな治療上のギャップです8。
臨床CADの経験を模倣するために、CABGに従順な慢性心筋虚血の革新的なブタモデルが作成されました9。ブタは心外膜橋の側副を持たないため、他の大型動物よりも心臓病の優れたモデルとなるため、LADの狭窄だけでは局所虚血を引き起こします10。この研究では、生後16週齢の雌のヨークシャーランドレース豚を使用しました。このモデルでは、左内乳腺動脈(LIMA)移植片を使用して、オフポンプCABGでLADを血行再建しました(補足表1)。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、収縮器が硬い装置であるため、狭窄を開くことはできません。心臓磁気共鳴画像法(MRI)は、全体的および地域的な機能、冠状動脈の解剖学的構造、および組織の生存率を評価するために使用されます。心臓MRI分析では、ピーク充填率(PFR)を特徴とする拡張期機能が、CABG6にもかかわらず損なわれたままであることが示されました。拡張期機能障害のメカニズムは、CABG11の後も持続するHIBのミトコンドリア生体エネルギーとコラーゲン形成の障害に関連している可能性があります。
間葉系幹細胞(MSC)は、エキソソームを介して治療シグナル伝達を行い、CABG中に適用した場合に心筋の回復を改善します。このブタモデルと並行した in vitro試験では 、CABG中に心外膜MSCビクリルパッチを配置すると、ミトコンドリアのエネルギー代謝の重要な調節因子である主要なミトコンドリアタンパク質、すなわちPGC-1α12が増加し、収縮機能が回復することが示されました13。 in vitro モデルにより、ミトコンドリア機能障害に対する間葉系幹細胞のシグナル伝達メカニズムを調べることができました。エクソソームは、マイクロRNA(miRNA)14を含むタンパク質または核酸を含む分泌安定性のあるマイクロベシクル(50-150 nm)です。最近の in vitro データでは、MSC由来のエクソソームがミトコンドリア呼吸の回復に必要な重要なシグナル伝達機構であることが示唆されています。
幹細胞由来のエクソソームは、容易に入手でき、商業的に生産でき、倫理的な対立がないため、有望な補助治療薬です。臨床翻訳を考慮し、MSC由来のエクソソームを包埋したコラーゲンパッチを作製し、心筋の冬眠領域に外科的に縫合できるようにしました。このパッチを用いてエクソソームの持続的な送達が可能であることが実証され、ミトコンドリアの回復を標的とし、ミトコンドリアの生合成を促進するパラクリンシグナル伝達機構を備えた無細胞再生療法が提供されることが実証された15。この手順は、ミトコンドリア機能を強化し、血行再建術時の炎症を軽減し、慢性虚血への筋細胞の適応を逆転させることによって心機能を改善するためのMSC由来の治療法の影響を研究するための前臨床モデルを提供します。
この研究では、CAD患者の標準治療を模倣した近位LAD狭窄の領域をバイパスするために、LIMAからLADへの吻合を使用してオフポンプCABGの外科的方法が示されています。CABGの併用療法として、MSC由来のエクソソーム包埋コラーゲンパッチを心筋虚血領域に外科的に適用することが実証されました。この手術モデルは、エクソソームパッチの使用で見られるパラクリン効果に対する生理学的反応と、回復の分子メカニズムを研究するために使用できます。
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Protocol
ミネアポリスVAメディカルセンターとミネソタ大学の動物実験委員会(IACUC)は、すべての動物実験を承認しました。実験動物の使用とケアに関する現在の国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従いました。
1. 間葉系幹細胞の単離とエクソソームの作製と特性評価
- 骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)の単離
- 生後20週齢の雌のヨークシャーランドレース豚の胸骨または脛骨から30〜50mLの無菌骨髄を採取します。これを行うには、25 mm 15G 骨間針を胸骨または脛骨に挿入し、10 mL のヘパリンを含む 60 mL シリンジにサンプルを引き出します。
注:骨髄の採取の詳細については、Pittenger et al.およびHocum-Stone et al.12,16を参照してください。 - 簡単に言うと、骨髄標本をヘパリンを含むVacutainer CPTチューブに通し、1800 x gで30分間通過させます。
- 単核球を含むバフィーコートを取り除き、ハンクの平衡塩溶液で洗浄します。遠心分離により単核細胞をペレット化し、増殖培地(10%ウシ胎児血清[FBS])に再懸濁します。
- 単核細胞を細胞培養フラスコに移し、接着増殖させます。付着性により、MSCを単核画分から単離します。
- 24時間以内にすべての非MSCを洗浄し、組織培養フラスコにMSCの単層を残します。フローサイトメトリーによりMSC表現型を確認し、造血マーカーであるCD45の陰性、およびMSCのマーカーであるCD90およびCD105の陽性性を確認します。
- 生後20週齢の雌のヨークシャーランドレース豚の胸骨または脛骨から30〜50mLの無菌骨髄を採取します。これを行うには、25 mm 15G 骨間針を胸骨または脛骨に挿入し、10 mL のヘパリンを含む 60 mL シリンジにサンプルを引き出します。
- ブタ間葉系幹細胞からのエクソソームの調製と特性評価
- 1 x 104 H9C2ラット心筋細胞を播種し、1x DMEM + 10% FBSおよび1x Pen/strepで培養します。2 x 104 ブタMSCを高度なDMEM + 5%FBSおよび1xペン/連鎖球菌で播種します。
- 両方の細胞株が80%以上コンフルエントになったら、培地をエクソソーム枯渇H9C2およびMSC培地に交換します。
- H9C2心筋細胞を軽度の低酸素状態(1%O2 2で24時間)に曝露する。24時間後に低酸素状態からフラスコを取り出し、H9C2培地をピペットで取り出します。
- MSCフラスコからMSCメディアを取り出し、廃棄します。精製したH9C2培地をMSCフラスコに加えます。フラスコを正常酸素条件(5%CO2、20%O2、および37°C)で6時間インキュベートします。
- メーカーの指示に従い、全エキソソーム単離試薬を用いて、共培養したコンディショニング培地からエキソソームを抽出します。
- CD-63(1:1000)に対する抗体を持つ一般的なエキソソームタンパク質のウェスタンブロット検出により、エクソソームの同定を確認します17。
- ナノ粒子追跡分析(NTA)を実行して、エクソソームを定量化し、ナノ粒子のサイズとその分布を評価します。これを行うには、エクソソームの総タンパク質(50μg)を500μLのPBSに溶解し、ナノ粒子追跡分析装置を使用してエクソソームの濃度とサイズ分布を決定します。
- ナノ粒子追跡ソフトウェアを使用してデータを解析します。
2.オフポンプ冠動脈バイパス移植手術
- 動物の準備
- 手術予定日の3日前に動物(生後16週齢の雌のヨークシャーランドレース豚)の体重を量ります。手術前に動物を12時間絶食させ、絶食中に水にアクセスできるようにします。
- 手術の2〜4時間前に筋肉内経路でブプレノルフィン0.18 mg / kgを投与します。.
- 動物の誘導
- 6.6 mg / kgのチレタミン-ゾラゼパム/キシラジンの筋肉内注射をして動物を鎮静させます。.
- 顎の緊張を評価して適切な鎮静を確保するために15分間待ち、続いて22Gのカテーテルを中耳静脈に配置します。
注:耳の静脈が不十分な場合は、別の末梢静脈(すなわち、橈側静脈)が考慮される場合があります。 - 眼科用軟膏を各眼に局所的に投与します。.全身麻酔を誘発するために、静脈内経路で1〜2 mg / kgのプロポフォールを投与します。.顎の緊張は麻酔の深さを最も確実に反映し、処置全体を通して評価する必要があります。
- 適切なサイズの気管内チューブで動物を挿管します。
- 手術
- 外科的処置の準備のために動物の胸骨と鼠径部を剃ります。
- 手術のために深い麻酔を維持するために、必要に応じて機械的換気を10〜15回/分、酸素1〜4 L / min、およびイソフルラン1.0〜3.0%に設定します。深い麻酔を確認するために、眼や顎の反射がないかどうかを確認します。
- 動物の位置監視装置(心電図、潮汐終末CO2、心拍数、酸素飽和度、血圧、体温)。
- IVカテーテルを生理食塩水または乳酸リンガー溶液の袋に接続して、メンテナンス液を継続的に投与します。
- ポビドン、ヨウ素スクラブ、溶液3xを使用した無菌技術を使用して皮膚を準備し、適切な無菌性を確保し、手術部位感染のリスクを最小限に抑えます。
- 不整脈を予防するために、血管内経路(負荷量2 mg / kgまたは50 mcg / kg / minの用量での連続注入)でリドカインを投与します。.
- 動物を背側に配置し、滅菌タオルで覆います。
- セルディンガー法による動脈ライン留置のために左または右の大腿動脈を切断し、その後、手術時に継続的な血圧モニタリングのためにカテーテルをトランスデューサーに接続します。
- 単極電気焼灼を使用して、胸骨切欠きから近位から遠位のキシフィス突起まで伸びる20cmの切開を行い、筋肉、皮下脂肪、結合組織の層を胸骨まで切開します。
- 振動鋸を使用して胸骨正中切開術を行います。
注:標準的な鋸は、LADコンストリクターを配置するために行われた左開胸手術による以前の心膜癒着による心筋損傷のリスクが高いため、胸骨切開術の繰り返しには避けられます。 - ハサミを使って胸骨後板を分割します。縦隔を適切に視覚化するために、専用の胸部リトラクターを使用してください。
- 単極電気焼灼またはメッツェンバウムのハサミを使用して癒着を解剖します。胸骨周囲の筋肉と脂肪を慎重に解剖して、左内乳腺動脈(LIMA)を露出させます。
- LIMAが胸骨縁の外側に露出したら、電気焼灼の先端で鈍い解剖を使用して胸壁から静かに分離します。LIMAをスケルトングラフトとして使用します。
- 3番目の 肋間腔のレベルで解剖を開始します。最適な視覚化のために、左胸骨の境界を静かに上げます。
- 外膜に穏やかな牽引力を使用して、LIMAの動脈枝と静脈枝を露出させます。ヘモクリップを使用して枝のLIMA側を切り取り、枝の胸壁側を焼灼します。
注意: LIMAのクリップを焼灼すると、導管が狭くなる可能性があるため、注意が必要です。 - LIMAの最初のセグメントが動員されたら、鎖骨下静脈のレベルに向かって近位に、LIMA分岐部まで遠位に解剖を続けます。
- 解剖が終了したら、100〜300 U / kgの用量で静脈内経路でヘパリンを投与します。.ヘパリンを投与してから3分間待ちます。
- 3分後、LIMA分岐のレベルの直前に、LIMAの遠位端をクリップし、導管を分割します。遠位端を無料の2-0シルク縫合糸タイで縫います。
- 移植のために近位端を準備します。グラフトを数秒間出血させて、流れの質を目視で検査します。
- 出血を避けるために、非外傷性ブルドッグクランプでLIMA導管の遠位端を静かにクランプします。逆T字型で心膜を開き、約5〜6cm切開します。心膜に3-0サイズの縫合糸を配置して、スリットの両側で牽引します。
- 胸骨リトラクターに固定されているシリコンリトラクションテープと組織スタビライザーでLADを安定させます。狭窄の遠位にあるLAD動脈(収縮帯が原因)を11枚刃で切り取り、虹彩ハサミで伸ばします。
- 適切なサイズの冠状動脈シャントをLADに配置します。オフポンプバイパス技術を使用して、7-0 の非吸収性縫合糸を実行して、LIMA から LAD への吻合を行います。LIMAのブルドッグオクルーダーを解放し、止血を確認します。
- 間葉系幹細胞(MSC)由来エクソソームパッチの作製
- MSCからのエクソソームの単離に成功したら、約3 x 108 エクソソームを3 mLの生理食塩水に懸濁し、コラーゲンスポンジに加えます。
- 3 mLのエクソソーム懸濁液を室温、約22°C、10分間加熱します。吸収性コラージュスポンジ2個(各1.27 cm x 2.54 cm)を中型のペトリ皿に入れます。
- 18Gの針を刺した5 mLのシリンジを使用して、エキソソーム懸濁液を穏やかに混合します。1.5 mLの懸濁液を各コラーゲンスポンジにゆっくりとピペットで移し、完全に吸収されるまで5分間待ちます。
- エクソソームパッチの配置
- エクソソームを含んだスポンジを、LADの分布における前中隔領域の心外膜である心臓の冬眠領域に逆さまに置きます。
- 心臓の冬眠領域を覆うように2つのスポンジをそっと置きます。3.5cm×1.0cmのポリグラクチンメッシュを1枚使用して、各コラーゲンスポンジを覆います。
- メッシュを心外膜に細かい7-0の断続縫合糸で縫い付けます。
- 胸部チューブ留置術
- 胸骨切開の下側付近の別の刺し傷切開部に胸部チューブを留置します。胸腔チューブを心臓の前方に慎重に置きます。
- チューブが所定の位置に収まったら、水平マットレスステッチを使用して3-0縫合糸で巾着糸を置き、チューブを取り外すときに傷口を閉鎖できるようにします。
- 胸部チューブは、胸部が完全に閉じるまで維持されます。
- 胸部閉鎖
- 胸骨を非吸収性縫合糸で8の字型パターンで近似します。切開の全長に沿って筋肉内経路で1 mg / kgのブピバカインを投与します。
注:MRI画像との干渉を避けるために、ワイヤーではなく縫合糸が使用されます。 - 筋肉と皮膚の層を、それぞれ2-0と3-0の吸収性縫合糸を使用して標準的な方法で閉じます。
- 息を止めて吸引し、胸腔からすべての空気を排出します。人工呼吸器の気道内圧を注意深く監視し、圧力を15〜22 mmHgに維持し、完了したら解放します。.
- すべての空気が排出されたら、巾着縫合糸を使用して傷口を閉じながら胸腔チューブを取り外します。胸骨切開部を覆うために局所的に接着剤を塗布します。
- 胸骨を非吸収性縫合糸で8の字型パターンで近似します。切開の全長に沿って筋肉内経路で1 mg / kgのブピバカインを投与します。
- 術後のケア
- 皮膚の切開が閉じられている間、動物を人工呼吸器から徐々に引き離します。動物を麻酔装置から外す前に、動物が自発的に呼吸し、反射を保護することができることを確認してください。
- 気管内チューブは、動物が気道を保護できることを確認してから取り外します。手術部位の感染を最小限に抑えるために、抗生物質軟膏を埋め込んだ無菌および非接着性包帯で皮膚切開部を覆います。
- 動物が補助なしでその位置を維持できるようになるまで、心拍数、呼吸数、体温などのバイタルサインを15分ごとに監視し続けます。
- 頭を持ち上げて持ち上げることができ、介助なしで立つことができるようになるまで、動物が放置されないようにしてください。動物を回収ユニットに輸送する前に、皮下経路で0.2 mg / kgの用量でメロキシカムを投与します。.
- 動物が安定しているときに、動物を回収ユニットに輸送します。術後3日目まで切開部位のドレッシングを保管してください。ドレッシングが汚れた場合は交換してください。
- 手術後の最初の5日間は、動物の痛み、皮膚切開、および全体的な健康状態のレベルを引き続き監視します。突発性疼痛のために、必要に応じてメロキシカムの半分の用量(0.1 mg / kg)を1日1回投与します。.
- 手術後最初の5日間は、切開部位が治癒するまでの間、他の動物による手術部位感染のリスクを減らすために、動物を1人で飼育します。5日後に動物をグループハウスに戻します。
- 合併症や動物の状態の変化(発熱、腹水、体重減少、食欲不振など)があれば、獣医師または適切なスタッフに報告してください。
3. 大腿骨アクセスを用いた冠動脈造影
- 背側横臥の手術台に動物を固定します。毎分10〜15回の呼吸で機械的換気を開始します。必要に応じて、酸素を2〜4 L / min、イソフルランを1%と4%に設定して、麻酔の深い平面を維持します。.
- 心電図リードを動物の手足に置き、心拍リズムを監視します。麻酔の深さについて動物を評価します。目や顎の反射がないときに深く麻酔をかけられた動物を考えてみましょう。
- 胸と首の部分をポビドンヨードスクラブできれいにしてから、動物をタオルで覆います。
- 外科的切除によって大腿動脈にアクセスし、大腿動脈と静脈を露出させます。大腿動脈に11番の刃で1〜2mmの縦方向に切開し、血管内腔に11Frイントロデューサーシースを使用して動脈をカニューレ挿入します。
- アクセスを取得した後、カテーテルを進めて冠動脈造影を行い、LIMA-LAD移植片の解剖学的開存性を評価します。
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Representative Results
血行再建術後、冠動脈造影を実施して、LAD狭窄症(80%以上)とLIMA-LAD移植片の開存性を評価します(図1)。血行再建術とエクソソーム含有コラーゲンパッチの留置から4週間後、心臓MRIを実施して、安静時およびストレス下での心臓の収縮期および拡張期機能を評価します 5μg/kg/minの低用量ドブタミン注入を使用します。収縮期機能は、壁の厚さのパーセンテージ(収縮末期の壁の厚さ-拡張末期の壁の厚さ)を測定することによって分析されます。拡張期機能は、拡張期末期容積(PFR/EDV; 図2)。遅延造影検査を実施して、LAD領域に心筋梗塞がないことを確認しました。LAD領域に梗塞が存在する場合、それは収縮筋によって引き起こされる血栓症に続発する動脈の閉塞が原因である可能性があります。局所的な壁運動異常の欠如は、冬眠表現型の欠如を示しています。
低用量のドブタミン注入では、HIB動物は対照群と比較して、PFR / EDVによって測定された拡張期機能の有意な低下を示します(5.5±0.8対. それぞれ6.9±1.5、p < 0.05)。CABG群は、HIB群と比較してPFR/EDVの改善傾向を示しています(それぞれ6.3±0.9対5.5±0.8、p = 0.06)。しかしながら、CABG + MSC群は、HIB群と比較してPFR/EDVの有意な増加を示す(6.6 ± 1.1 vs 5.5±0.8、それぞれp=0.03; 図3)。心臓MRIを使用して、狭窄領域の遠位にある左前下行動脈(LAD)への左内乳腺動脈(LIMA)の壊死と開存性の欠如を確認しました18。
安静時、CABG+MSC群は、CABG単独と比較して、所属収縮期機能(壁厚の割合で測定)を変化させなかった(26.3%±7.0%対34.9%±6.3%;p = 0.19)。ストレス下では、CABG+MSC群はCABG単独群と比較して局所収縮機能に有意な改善を示した(78.3%±19.6%対39.2%±5.6%;p = 0.05)12 (図4)。
剖検では、適切なサイズの冠動脈拡張器を使用して、LAD狭窄とLIMA開存性を確保しました。心筋は、組織の生存率がすべての領域、特に虚血領域に存在することを確認するために、肉眼的に検査されました。塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色により、瘢痕がないことが確認されました。
図 1.解剖学的構造を示す心臓血管造影。 冠動脈造影は、近位LAD動脈の>80%狭窄と特許LIMA-LAD移植片吻合を示しています。略語: LIMA= 左内乳腺動脈、LAD= 左前下行 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.拡張期弛緩、全体的な収縮機能、および心臓MRIを使用した生存率の評価。 (A)拡張期弛緩:心周期中の左心室(LV)容積の関係。x 軸は s 単位の時間です。y軸は左心室の容積(mL)です。赤い線はピーク充填率(LVが体積を増加させる最速速度)を示します。PFR は、動物間のサイズのばらつきを説明するために、動物の拡張末期容積 (PFR/EDV) に正規化されます。(B)総収縮機能:心周期中の分節円周緊張(循環緊張)(x軸:ミリ秒単位の時間、y軸:拡張末期測定と比較した左心室セグメントの円周長の変化率)。円周方向のひずみのピークは、サイクルの最も負の値で表されます。(C)LAD分布の代表的な心臓MRI画像:LAD分布が赤で強調表示され、前中隔壁を表します。(D)長軸と(E)短軸の4つのチャンバーでガドリニウムコントラストが増強されたことに基づく梗塞の証拠はありませんでした。略語:LV =左心室/心室;LAD =左前方下降;MRI=磁気共鳴画像法。この図は 6 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 3.ピーク充填率/拡張期末期容積のMRI評価。 PFR/EDVで測定した拡張期機能を4群(対照群、HIB、CABG、CABG + MSC)で比較した。安静時、PFR/EDVは4つの動物群間で同等である。しかし、低用量ドブタミン注入(5μg/kg/min)を用いたストレス下では、HIB群は対照群と比較してPFR/EDVの有意な低下(p < 0.05)を示し、CABG群では改善(p = 0.06)およびCABG+MSC群では有意な増加(p < 0.05)の傾向を示しました。統計分析は、一元配置分散分析(ANOVA)検定を使用して実行されました。データはSD±手段として提示されます。 略語:CABG =冠動脈バイパス移植、PFR =ピーク充填率、EDV =拡張期末期容積;MRI =磁気共鳴画像法、MSC =間葉系幹細胞、SD=標準偏差。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4.壁厚化%による局所収縮機能のMRI評価 MSCパッチによる治療は、偽パッチと比較して局所心機能の改善を示します。(A)壁の肥厚率で測定される局所収縮期機能は、偽(n = 6)と比較して、MSCパッチ治療(n = 6)で安静時に有意に改善しません。(B)低用量ドブタミン注入(5μg/kg/min)を用いたストレス下では、MSCパッチ投与後、偽動物と比較して局所収縮機能が有意に改善した(P<.05)。統計解析は、Mann-Whitney検定を用いて行った。横棒は平均標準偏差を示します。*P<.05.略語:MSC =間葉系幹細胞。この数値は 12 から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
付表1.手順の概要と各手順のタイムライン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、慢性虚血性心筋の初めてのブタモデルを提示し、外科的血行再建術中にMSC由来のエクソソームを含むコラーゲンパッチによる治療が、ミトコンドリアの回復を標的とすることにより、異方性刺激時に拡張期および収縮期機能が回復することを示しました。以前、HIBの大型動物モデルでは、心臓MRIで測定された拡張期および収縮期機能は損なわれたままであり、完全に回復することなく血行再建術でわずかに改善するだけであることが実証されました6,19。機能障害は、左心室駆出率が維持されているにもかかわらず発生しました。.これらの所見は、左心室機能が維持された単一血管領域の慢性虚血性心筋患者に見られる臨床経験を正確に模倣しています。
血行再建術中、特に以前の開胸術の設定では、いくつかの重要かつ技術的な課題があります。胸骨への入口での心血管損傷は、心膜がすでに破られており、癒着が存在する可能性があるため、リスクです。胸骨切開術は、胸骨への接近または付着により心臓損傷を引き起こす可能性があります。このリスクは、振動鋸を使用することで軽減でき、平穏な胸骨の再突入を促進することが示されています。
CABGを成功させるための重要な側面は、移植片の品質です。細心の注意を払ったLIMA採取は、高品質のCABGを成功させるための重要な技術的側面であり、移植片の開存性の改善に関連しています。LIMAは、椎弓根とスケルトン化の2つの技術を使用して収穫できます。椎弓根技術には、胸骨からLIMAをその静脈、筋膜、脂肪、およびリンパ管とともに解剖することが含まれます。スケルトン技術には、LIMAを解剖して周囲のすべての組織を解放することが含まれるため、動脈はわずか20個になります。このモデルでは、胸骨虚血を最小限に抑えることができ、移植片が椎弓根LIMA20よりも長いため、スケルトン化技術が実装されました。LIMAはデリケートな構造であるため、過度のストレッチ、クランプ、またはクリップの位置の誤りは、血管損傷や満足のいく結果をもたらす可能性があります。解剖中は、焼灼の先端を注意して低電圧で使用する必要があります。動脈をその穿孔枝から分離するとき、枝のLIMA側はヘモクリップを使用して切り取られます。クリップを焼灼すると、導管が狭くなる可能性があるため、注意が必要です。移植前に拍動性の流れを確認してください。
手術中の動きを最小限に抑えるために、適度な量の麻酔と麻痺薬が維持されていることを確認してください、特に吻合を縫製している間。不整脈と血栓症のリスクをそれぞれ排除するために、適切な用量のリドカインとヘパリン(200〜300単位/ kg)を使用することが重要です。.リドカインの2回目の投与は、動物が手術中に不整脈を経験した場合に適応される場合があります。.大腿動脈ラインの使用により、継続的な血行動態モニタリングが可能になります。吻合を行うときは、心臓の後ろに1〜2個の外科用スポンジを置くか、心膜の両側に縫合糸を配置して左心室を上向きに持ち上げることが有用です。このモデルでは、シラスティックテープと、吸引圧力を利用して標的部位を効果的に固定する組織安定剤を使用します。心電図のST低下に加えて、動脈血圧の軽度の低下が、安定剤が配置され、心臓が持ち上げられると見られる場合があります。これらの血行動態障害は、通常、介入を必要とせずに忍容性が良好です。血行動態の不安定性が著しい状況では、静脈内経路を介してフェニレフリン(5〜20 μg / kg)の用量を投与して動脈血圧を上げることができます。.血行動態の不安定性が生命を脅かす場合は、エピネフリンの用量(0.1 μg / kg;希釈1:10,000)を緊急救助薬として静脈内経路で投与できます。.LADをビーバーブレードで露出させた後、11枚刃で動脈切開を行い、マイクロサージェリーハサミで完了します。この操作中にLADの後壁を傷つけないように注意する必要があります。正確な縫合を可能にするために、オフポンプCABG中に動脈切開部位を無血に保つことが重要であり、生理食塩水による断続的な洗浄、CO2ブロワーの使用、および管腔内冠状動脈シャントを含むいくつかの技術が説明されています21。この研究では、CO2ブロワーと適切なサイズの管腔内冠状動脈シャントが使用され、どちらもオフポンプCABG操作で日常的に使用されています。CO2ミスターブロワーの致命的な合併症は、空気塞栓症です。ただし、動脈切開術内の物理的なバリアとして機能する冠状動脈シャントを使用することで、空気塞栓症のリスクを打ち消すことができます。さらに、冠状動脈シャントの使用は、手術野を無血に保つのに役立ち、より低いガス流量の使用を可能にし、空気塞栓症のリスクをさらに最小限に抑えます。シャントはまた、吻合のための技術的精度を向上させ、縫合中の動脈の後壁への不注意な損傷を防ぐ22。
この確立されたブタモデルでは、CABG手術中にオンポンプではなくオフポンプ技術が採用されました。オンポンプの代わりにこの技術を使用する利点は、手術時間を最小限に抑え、完全なヘパリン化を伴う大動脈と右心房の中心カニューレ挿入を回避することです。さらに、術後の出血や心臓のテンポナードのリスクを減らすことで、手術後の動物の回復を早めます。これらは、オンポンプとオフポンプの両方でCABGを受けている患者の臨床経験に基づいて推定される利点です。.
このエキソソームを含有したコラーゲンパッチは、血行再建術を受けた虚血の領域に定量化して外科的に固定できるという点で新規です。これにより、数日間にわたってパッチからエキソソームが持続的に放出され、虚血領域の連続的かつ直接的な治療が可能になります。CABGとエクソソームによる治療から4週間後の冬眠組織の病理組織学では、パッチ自体に対する心筋の炎症反応の欠如が示されましたが、炎症細胞の染色によって明らかなように、縫合部位にいくつかの炎症が認められました。エクソソームを心筋に送達するためには様々な方法が提案されているが、エクソソームの直接注入などの一般的な技術では、エクソソームの最大90%が注射後に洗い流されたり分散したりするため、損傷部位における治療薬の保持が低くなる23。注入後のエキソソーム保持の分析は、注入後最大3時間で完了し、エキソソーム含量の有意な減少を示している24。エクソソームは単離が容易で、長期間にわたる保管条件の柔軟性が高いため、急性期に使用できる既製の製品が患者に翻訳されやすくなる可能性があります。
この研究には、動物の年齢や性別など、いくつかの制限があります。外科的および物流上の制限、動物福祉規制およびスタッフの安全に関する考慮事項を考慮して、若い雌豚のみが研究されました。CABG手術はモデルの複雑さを増しますが、他の低侵襲的介入(経皮的冠動脈インターベンションまたはPCI)では、狭窄器の硬い性質のためにLADの狭窄領域を開くことができないため、必要な介入でした18。さらに、併存疾患のない単血管狭窄症のこのモデルは、ヒト集団に見られる長年の冠動脈アテローム性動脈硬化症の程度と影響を完全にシミュレートしていません。今後の研究では、回旋動脈とLADに収縮筋を外科的に配置することにより、冬眠中の心筋の多血管疾患モデルを使用することに焦点を当てます。しかし、この2血管疾患モデルでは、駆出率が低下した冬眠中の心筋が発生します。動物の死亡率は増加する可能性が高く、外科的血行再建術はより複雑であり、ポンプ上のバイパスサポートが必要です。将来的には、パッチタイプの実用化に問題がある場合は、脱細胞化細胞外マトリックスや代替形態のハイドロゲルなど、他の足場材料の選択肢が検討されます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、米国(U.S.)のVA Merit Review #I01 BX000760(RFK)の支援を受けました。退役軍人省BLR&Dおよび米国退役軍人省助成金 #I01 BX004146(TAB)。また、ミネソタ大学リレヘイ心臓研究所の支援にも感謝します。この作業の内容は、米国政府の米国退役軍人省の見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Ethibond | Ethicon | MG46G | Suture |
| # 40 clipper blade | Oster | 078919-016-701 | Remove hair from surgery sites |
| 0 Vicryl | Ethicon | J208H | Suture |
| 1 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1188100777 | Administer injectable agents |
| 1" medical tape | Medline | MMM15271Z | Secure wound dressing and IV catheters |
| 1000mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1324X | IV replacement fluid |
| 12 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881512878 | Administer injectable agents |
| 18 ga needles | BD | 305185 | Administration of injectable agents |
| 20 ga needles | BD | 305175 | Administration of injectable agents |
| 20 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881520657 | Administer injectable agents |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J317H | Suture |
| 250 mL 0.9% saline | Baxter | UE1322D | Replacement IV Fluid |
| 3 mL Syinge | Medtronic/Covidien | 1180300555 | Administer injectable agents |
| 3-0 Vicryl | Ethicon | VCP824G | Suture |
| 36” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX563 | Connect art. Line to transducer |
| 4.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43040 | Establish airway for Hibernation |
| 4-0 Tevdek II Strands | Deknatel | 7-922 | Suture to secure constrictor around LAD |
| 48” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX564 | Connect art. Line to transducer |
| 500mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1323Q | Drug delivery, Provide mist for Blower Mister |
| 6 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1180600777 | Administer injectable agents |
| 6.0 mm ID endotracheal tube | Mallinckrodt | 86049 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6.5 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43065 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6” pressure tubing line | Smith’s Medical | MX560 | Collect bone marrow |
| 60 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881560125 | Administer injectable agents |
| 7.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43070 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 7-0 Prolene | Ethicon | M8702 | Suture |
| Advanced DMEM (1X) | ThermoFisher Scientific | 12491023 | |
| Alcohol Prep pads | MedSource | MS-17402 | Skin disinfectant |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC910024 | |
| Anesthesia Machine | Drager | Fabious Trio | maintains general anesthesia |
| Anesthesia Machine + ventilator | DRE Drager- Fabius Tiro | DRE0603FT | Deliver Oxygen and inhalant to patient |
| Anesthesia Monitor | Phillips Intellivue | MP70 | Multiparameter for patient safety |
| Arterial Line Kit | Arrow | ASK-04510-HF | Femoral catheter for blood pressure monitoring |
| Artificial Tears | Rugby | 0536-1086-91 | Lubricate eyes to prevent corneal drying |
| Bair Hugger | 3M | Model 505 | Patient Warming system |
| Basic pack | Medline | DYNJP1000 | Sterile drapes and table cover |
| Blood Collection Tubes- green top | Fisher Scientific | 02-689-7 | Collect microsphere blood samples |
| Blower Mister Kit | Medtronic/Covidien | 22120 | Clears surgical field for vessel anastomosis |
| BODIPY TR Ceramide | ThermoFisher Scientific | D7540 | |
| Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle | Vidacare | 9001-VC-005 | Collect bone marrow |
| Bone Wax | Medline | ETHW31G | Hemostasis of cut bone |
| Bovie Cautery hand piece | Covidien | E2516 | Hemostasis |
| Bupivicaine | Pfizer | 00409-1161-01 | Local Anesthetic |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Sigma Aldrich | B9275 | Pre operative Analgesic for survivial procedures |
| Cell Scrapers | Corning | 353085 | |
| Cephazolin 1 gr | Pfizer | 00409-0805-01 | Antibiotic |
| Chest Tube | Covidien | 8888561043 | Evacuates air from chest cavity |
| Cloroprep | Becton Dickenson | 260815 | Surgical skin prep |
| CPT tube | BD | 362753 | MSC isolation from bone marrow |
| Delrin Constrictor | U of MN | Custom made | Creates stenosis of LAD |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Skin adhesive |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430062 | |
| Dobutamine 12.5 mg/mL | Pfizer | 00409-2344-01 | Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection |
| ECG Pads | DRE | 1496 | Monitor heart rhythm |
| Exosome-Depleted FBS | ThermoFisher Scientific | A2720801 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| Femoral and carotid introducer | Cordis- J&J | 504606P | femoral and carotis cannulas |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS | ThermoFisher Scientific | 16140089 | |
| Flo-thru 1.0 | Baxter | FT-12100 | used to anastomos LIMA to L |
| Flo-thru 1.25 | Baxter | FT-12125 | FT-12125 |
| Flo-thru 1.5 | Baxter | FT-12150 | FT-12150 |
| Flo-thru 2.0 | Baxter | FT-12200 | FT-12200 |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Clipper | Oster | 078566-011-002 | Remove hair from surgery sites |
| Helistat collagen sponge | McKesson | 570973 1690ZZ | Sponge for embedding exosomes |
| Heparin | Pfizer | 0409-2720-03 | anticoaggulant |
| Histology Jars | Fisher Scientific | 316-154 | Formalin for tissue samples |
| HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30071.03 | |
| Hypafix | BSN Medical | 4210 | Secure wound dressing and IV catheters |
| Isoflurane | Sigma Aldrich | CDS019936 | General Anesthestic- Inhalant |
| IV Tubing for Blower Mister | Carefusion | 42493E | Adapts to IV Fluids for Blower/Mister |
| Jelco 18 ga IV catheter | Smiths medical | 4054 | IV access in Revasc, MRI and Term |
| Lidocaine 2% | Pfizer | 00409-4277-01 | Local Anesthetic/ antiarrthymic |
| Ligaclips | Ethicon | MSC20 | Surgical Staples for LIMA takedown |
| Long blade for laryngoscope | DRE | 12521 | Allows for visualization of trachea for intubation |
| Meloxicam 5 mg/mL | Boehringer Ingelheim | 141-219 | Post operative Analgesic |
| Microsphere pump | Collect blood samples from femoral introducer | ||
| Monopolar Cautery | Covidien | Valleylab™ FT10 | Hemostasis |
| Nanosight NS 300 | Malvern Panalytical | MAN0541-03-EN | |
| NTA 3.1.54 software | Malvern Panalytical | MAN0520-01-EN-00 | |
| OPVAC Synergy II | Terumo Cardiovascular System | 401-230 | Heart positioner and Stabilizer |
| Oxygen Tank E cylinder | various | various | Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter |
| PBS, pH 7.2 | ThermoFisher Scientific | 20012050 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | ThermoFisher Scientific | 15640055 | |
| Pigtail 145 catheter 6 French | Boston Scientific | 08641-41 | Measure LV pressures |
| Pressure Transducer | various | Must adapt to anesthesia monitor | Monitor direct arterial pressures |
| Propofol | Diprivan | 269-29 | Induction agent |
| Roncuronium | Mylan | 67457-228-05 | Neuromuscular blocking agent |
| SR Buprenorphine 10 mg/mL | Abbott Labs | NADA 141-434 | Post operative Analgesic |
| Sterile Saline 20 mL | Fisher Scientific | 20T700220 | Flush for IV catheters |
| Sternal Saw/ Necropsy Saw | Thermo Fisher | 812822 | Used to open chest cavity |
| Stop Cocks | Smith Medical | MX5311L | 2 to connect to pig tail |
| Succinylcholine 20 mg/mL | Pfizer | 00409-6629-02 | Neuromuscular blocking agent |
| Suction tubing | Medline | DYND50223 | |
| Suction Container | Medline | DYNDCL03000 | |
| Surgery pack with chest retractor | various | See pack list | Femoral cut down and median sternotomy |
| Surgical Instruments | various | See pack list | Femoral and carotid cutdowns and sternotomy |
| Surgical Spring Clip | Applied Medical | A1801 | Clamp end of LIMA after takedown |
| Syringe pump | Harvard | Delivers IV Dobutamine infusion | |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Millipore Sigma | S32703 | |
| Telazol 100 mg/mL | Fort Dodge | 01L60030 | Pre operative Sedative |
| Telpha pad | Covidien | 2132 | Sterile wound dressing |
| Timer | Time collection of blood samples | ||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher Scientific | 4478359 | |
| TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE | ThermoFisher Scientific | TP90076 | |
| Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 23734 | Topical over wound |
| Vicryl mesh | Ethicon | VKML | Patch for epicardial cell application |
| Vortex | Mix microspheres | ||
| Xylazine 100 mg/mL | Vedco | 468RX | Pre operative Sedative/ analgesic |
References
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