Summary
本研究提出了进行性冠状动脉狭窄导致的慢性心肌缺血的外科猪模型，导致心脏功能受损而无梗死。缺血后，动物接受非体外循环冠状动脉旁路移植术，心外膜放置干细胞来源的富含外泌体的胶原蛋白贴片。这种辅助治疗可改善心肌功能和恢复。
Abstract
进行性冠状动脉狭窄导致的慢性心肌缺血导致冬眠心肌 （HIB），HIB 定义为通过降低代谢活动来适应氧气供应减少的心肌，从而防止不可逆的心肌细胞损伤和梗死。这与心肌梗死不同，因为 HIB 具有通过血运重建恢复的潜力。患有严重冠状动脉疾病 （CAD） 的患者会出现慢性缺血，这使他们面临心力衰竭和猝死的风险。重度冠状动脉旁路移植手术 （CABG） 是重度冠状动脉旁路移植手术 （CABG），但它已被证明是一种不完美的治疗方法，但尚无辅助疗法来恢复适应慢性缺血的肌细胞。 为了解决这一差距，使用适合 CABG 并模拟临床场景的猪 HIB 手术模型。该模型涉及两次手术。第一次手术涉及在左前降支 （LAD） 上植入 1.5 mm 的刚性收缩器。随着动物的生长，蟒蛇逐渐引起明显的狭窄，导致区域收缩功能下降。一旦狭窄达到 80%，心肌血流和功能就会受损，从而产生 HIB。然后使用左乳内动脉 （LIMA） 进行非体外循环 CABG，以使缺血区域血运重建。动物恢复一个月，以便在牺牲前获得最佳的心肌改善。这允许对不同的治疗组进行生理和组织研究。该动物模型表明，尽管进行了 CABG，但心脏功能仍然受损，这表明需要新的辅助干预。在这项研究中，开发了一种嵌入间充质干细胞 （MSC） 衍生外泌体的胶原贴片，该贴片可以通过手术应用于 LIMA 吻合口远端的心外膜表面。该材料符合心外膜，可吸收，并为信号因子的持续释放提供支架。这种再生疗法可以刺激心肌恢复，而仅对血运重建没有反应。该模型通过提供有关 HIB 恢复的生理和机制探索手段，转化为临床领域。
Introduction
在全球范围内，重症冠状动脉疾病影响超过一亿患者，尽管死亡率有所下降，但它仍然是导致死亡的主要原因之一1,2。冠状动脉疾病的临床范围很广，从心肌梗死 （MI） 到缺血，但仍能存活。大多数临床前研究都集中在心肌梗死上，其特征是存在梗死组织，因为可以在小型和大型动物模型中进行研究。然而，该模型并不能解决保留活力和适合血运重建的患者。大多数接受 CABG 的患者血液供应减少和功能受限，同时保持收缩储备和活力的可变性 3.如果不进行治疗，这些患者可能会进展为晚期心力衰竭和猝死，尤其是在工作量增加的情况下 4.在这些患者中，冠状动脉旁路移植术 （CABG） 是一种有效的治疗方法，但可能无法完全恢复功能5。重要的是，舒张功能障碍是较差临床结果的标志，在血运重建后无法恢复，这表明在 CABG 6,7 期间需要新的辅助治疗。目前，尚无临床上可用的辅助干预措施与 CABG 一起使用，以将心肌细胞恢复到全部功能能力。这是一个重大的治疗差距，因为尽管进行了适当的血运重建，但许多患者仍会发展为晚期心力衰竭8。
创建了一种适合 CABG 的创新猪慢性心肌缺血模型，以模拟临床 CAD 经验9。与其他大型动物相比，猪提供了良好的心脏病模型，因为它们没有心外膜桥接侧支，因此仅 LAD 狭窄会导致局部缺血10。在这项研究中，使用了 16 周龄的雌性约克郡长白猪。在该模型中，使用左乳内动脉 （LIMA） 移植物通过非体外循环 CABG 对 LAD 进行血运重建（补充表 1）。经皮冠状动脉介入治疗 （PCI） 无法打开狭窄，因为收缩器是一种刚性装置。心脏磁共振成像 （MRI） 用于评估整体和区域功能、冠状动脉解剖结构和组织活力。心脏 MRI 分析显示舒张功能，其特征是峰值充盈率 （PFR），尽管进行了6 次 CABG，但舒张功能仍然受损。舒张功能障碍的机制可能与 CABG11 后持续存在的 HIB 中线粒体生物能量学和胶原形成受损有关。
间充质干细胞 （MSC） 在 CABG 期间应用时通过外泌体提供治疗信号传导，以改善心肌恢复。在该猪模型和平行 体外 研究中，表明在 CABG 期间放置心外膜 MSC vicryl 贴片可恢复收缩功能，增加关键线粒体蛋白，即 PGC-1α12，线粒体能量代谢的重要调节剂13。 体外 模型使我们能够研究间充质干细胞对线粒体功能受损的信号传导机制。外泌体是分泌的稳定微囊泡 （50-150 nm），含有蛋白质或核酸，包括 microRNA （miRNA）14。最近的 体外 数据表明，MSC衍生的外泌体是恢复线粒体呼吸所必需的重要信号转导机制。
干细胞衍生的外泌体是有前途的辅助疗法，因为它们很容易获得，可以商业化生产，并且没有伦理冲突。考虑到临床转化，创建了一种嵌入 MSC 衍生外泌体的胶原蛋白贴片，可以通过手术缝合到心肌的冬眠区域。结果证明，使用该贴片可以持续递送外泌体，并提供一种具有旁分泌信号转导机制的无细胞再生疗法，该机制针对线粒体恢复并增强线粒体生物发生15。该程序提供了临床前模型，用于研究间充质干细胞衍生疗法的影响，通过增强线粒体功能和减少血运重建时的炎症来改善心脏功能，并逆转肌细胞对慢性缺血的适应。
在这项研究中，展示了一种使用 LIMA 到 LAD 吻合术的离体外循环 CABG 手术方法，以绕过近端 LAD 狭窄区域，模拟 CAD 患者的标准治疗。作为 CABG 的辅助治疗，证明了 MSC 来源的外泌体包埋胶原贴片在心肌缺血区的手术应用。该手术模型可用于研究使用外泌体贴片对旁分泌效应的生理反应以及恢复的分子机制。
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Protocol
明尼阿波利斯退伍军人医疗中心和明尼苏达大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）已经批准了所有的动物研究。遵循了美国国立卫生研究院（NIH）关于使用和护理实验动物的现行指南。
1. 间充质干细胞的分离及外泌体的制备和表征
- 骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离
- 从 20 周龄雌性约克郡长白猪的胸骨或胫骨获取 30-50 mL 无菌骨髓。为此，将 25 mm 15G 骨间针插入胸骨或胫骨，并将样本吸入装有 10 mL 肝素的 60 mL 注射器中。
注意：有关骨髓收集的更多详细信息，请参阅Pittenger等人和Hocum-Stone等人12,16。 - 简而言之，将骨髓标本通过含有肝素的Vacutainer CPT管以1800×g的速度持续30分钟。
- 去除含有单核细胞的血沉棕黄层，并用Hank的平衡盐溶液洗涤。通过离心沉淀单核细胞并重悬于生长培养基（10%胎牛血清[FBS]）中。
- 将单核细胞转移到细胞培养瓶中进行贴壁生长。通过其贴壁性将MSC从单核部分中分离出来。
- 在24小时内洗涤所有非MSC，在组织培养瓶中留下单层MSC。通过流式细胞术确认 MSC 表型，确保 CD45（造血标志物）呈阴性，CD90 和 CD105（MSC 标志物）呈阳性。
- 从 20 周龄雌性约克郡长白猪的胸骨或胫骨获取 30-50 mL 无菌骨髓。为此，将 25 mm 15G 骨间针插入胸骨或胫骨，并将样本吸入装有 10 mL 肝素的 60 mL 注射器中。
- 猪间充质干细胞外泌体的制备和表征
- 将 1 x 104 个 H9C2 大鼠心肌细胞接种并在 1x DMEM+ 10% FBS 和 1x Pen/链球菌中培养。在高级 DMEM + 5% FBS 和 1x Pen/链球菌中播种 2 x 104 个猪 MSC。
- 一旦两种细胞系至少 80% 汇合，将培养基更换为外泌体耗尽的 H9C2 和 MSC 培养基。
- 将H9C2心肌细胞暴露于轻度缺氧（1%O2 持续24小时）。24小时后从缺氧中取出烧瓶，移出H9 C 2培养基。
- 从 MSC 烧瓶中取出并丢弃 MSC 培养基。将纯化的 H9C2 培养基加入 MSC 烧瓶中。在常氧条件下（5%CO 2,20%O2和37°C）孵育烧瓶6小时。
- 按照制造商的说明，使用总外泌体分离试剂从共培养的条件培养基中提取外泌体。
- 通过使用抗 CD-63 抗体 （1：1000） 17 的常见外泌体蛋白进行蛋白质印迹检测来验证外泌体的鉴定。
- 进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）以量化外泌体并评估纳米颗粒大小及其分布。为此，将外泌体的总蛋白（50μg）溶解在500μL PBS中，以使用纳米颗粒跟踪分析仪确定外泌体的浓度和大小分布。
- 使用纳米颗粒跟踪软件分析数据。
2.离体外循环冠状动脉旁路移植手术
- 动物准备
- 在计划手术前 3 天称量动物（16 周龄雌性约克郡长白猪）。手术前禁食动物12小时，同时在禁食期间喝水。
- 手术前 2-4 小时通过肌内注射途径给予丁丙诺啡 0.18 mg/kg。
- 动物的诱导
- 通过肌肉注射 6.6 mg/kg 替他明-唑拉西泮/甲苯噻嗪来镇静动物。
- 等待 15 分钟，通过评估下颌张力，然后在中央耳静脉中放置 22G 导管，以确保充分镇静。
注意：如果耳静脉不足，可以考虑另一种外周静脉（即头静脉）。 - 将眼药膏局部施用于每只眼睛。通过静脉注射途径给予 1-2 mg/kg 异丙酚以诱导全身麻醉。下颌张力最可靠地反映了麻醉的深度，应在整个手术过程中进行评估。
- 用适当尺寸的气管插管插管动物。
- 手术
- 剃掉动物的胸骨和腹股沟，为外科手术做准备。
- 根据需要将机械通气设置为每分钟 10-15 次呼吸，氧气 1-4 L/min，异氟醚 1.0-3.0%，以维持手术深度麻醉。检查眼部或下颌反射是否消失，以确认深度麻醉。
- 动物的位置监测设备（心电图、潮气末 CO2、心率、血氧饱和度、血压和体温）。
- 将静脉导管连接到一袋生理盐水或乳酸林格溶液上，以持续给予维持液。
- 使用无菌技术准备皮肤，包括聚维酮碘磨砂膏和 3 次溶液，以获得充分的无菌效果，并将手术部位感染的风险降至最低。
- 通过血管内途径给予利多卡因（负荷剂量为 2 mg/kg 或以 50 mcg/kg/min 的剂量连续输注）以预防心律失常。
- 将动物放在背部并用无菌毛巾覆盖。
- 通过 Seldinger 技术切开左股动脉或右股动脉以放置动脉管路，然后将导管连接到换能器，以便在手术时进行连续血压监测。
- 使用单极电烙术做一个 20 cm 的切口，从胸骨切迹近端向下延伸到远端的木突，并将肌肉、皮下脂肪和结缔组织层切开至胸骨。
- 使用摆动锯进行正中胸骨切开术。
注意：重复胸骨切开术应避免使用标准锯，因为先前为放置 LAD 收缩器而进行的左开胸手术导致心包粘连的风险更高。 - 用一把剪刀分开胸骨后板。使用专门的胸牵开器来充分观察纵隔。
- 使用单极电烙术或 Metzenbaum 剪刀解剖粘连。仔细解剖胸骨周围肌肉和脂肪，以暴露左乳内动脉 （LIMA）。
- 一旦 LIMA 暴露在胸骨边缘的外侧，使用带有电烙尖端的钝解剖将其与胸壁轻轻分开。将 LIMA 用作镂空移植物。
- 在第 3肋 间隙水平开始解剖。轻轻抬高胸骨左缘以获得最佳可视化效果。
- 对外膜使用轻柔的牵引，以暴露LIMA的动脉和静脉分支。使用血唇夹住树枝的LIMA侧，并烧灼树枝的胸壁侧。
注意： 必须注意不要烧灼 LIMA 上的夹子，因为这可能会导致导管变窄。 - 一旦 LIMA 的初始节段被动员，继续向锁骨下静脉水平近端和远端解剖，直到 LIMA 分叉。
- 解剖完成后，通过静脉注射途径给予肝素，剂量为100-300U / kg。给予肝素后等待3分钟。
- 3分钟后，夹住LIMA的远端，就在LIMA分叉的水平之前，并分开导管。用免费的 2-0 真丝缝合带缝合远端。
- 准备近端进行移植。通过让移植物出血几秒钟来目视检查流体质量。
- 用无创伤的斗牛犬夹轻轻夹住 LIMA 导管的远端，以避免出血。用倒 T 形打开心包，做一个大约 5-6 厘米的切口。在心包上放置 3-0 尺寸的缝合线，以便在狭缝两侧进行牵引。
- 用硅胶回缩胶带和组织稳定器稳定 LAD，该稳定器固定在胸骨牵开器上。用 11 刀片在狭窄远端（由收缩带引起）的 LAD 动脉进行动脉切开术，并用虹膜剪刀伸展。
- 在 LAD 中放置适当大小的冠状动脉分流器。使用非泵旁路技术使用 7-0 运行不可吸收缝合线进行 LIMA 至 LAD 吻合术。松开 LIMA 上的斗牛犬封堵器并确认止血。
- 间充质干细胞（MSC）来源的外泌体贴片的制备
- 从间充质干细胞中成功分离外泌体后，将大约 3 x 108 个外泌体悬浮在 3 mL 生理盐水中并添加到胶原海绵中。
- 将3mL外泌体悬浮液在22°C左右的室温下加热10分钟。将 2 块可吸收的拼贴海绵（每块 1.27 厘米 x 2.54 厘米）放入培养皿中。
- 使用 5 mL 注射器和 18G 针头轻轻混合外泌体悬浮液。缓慢地将 1.5 mL 悬浮液移液到每个胶原海绵上，等待 5 分钟以完全吸收。
- 外泌体贴片的放置
- 将含有外泌体的海绵倒置在心脏的冬眠区域，该区域是LAD分布中前隔区域的心外膜。
- 轻轻地放置两块海绵以覆盖心脏的冬眠区域。使用一个 3.5 cm x 1.0 cm 的聚胶乳蛋白网覆盖每个胶原海绵。
- 用 7-0 间断缝合线将网状物缝合到心外膜上。
- 胸管置入
- 通过单独的刺伤切口放置胸管，靠近胸骨切开切口的下侧。小心地将胸管放在心脏的前侧。
- 管子就位后，使用水平床垫缝线放置带有 3-0 缝合线的钱包绳缝合线，以便在取出管子时闭合伤口。
- 胸管一直维持到胸部完全闭合。
- 胸部闭合
- 使用八字形图案使用不可吸收的缝合线近似胸骨。沿切口的整个长度通过肌内途径给予 1 mg/kg 布比卡因。
注意： 使用缝合线而不是电线，以避免干扰 MRI 成像。 - 分别使用 2-0 和 3-0 可吸收缝合线以标准方式闭合肌肉和皮肤层。
- 进行屏气和吸气，将所有空气排出胸腔。谨慎监测呼吸机上的气道压力，将压力保持在 15-22 mmHg 之间，完成后释放。
- 排空所有空气后，拔出胸管，同时使用钱包线缝合伤口。局部涂抹胶水覆盖胸骨切口。
- 使用八字形图案使用不可吸收的缝合线近似胸骨。沿切口的整个长度通过肌内途径给予 1 mg/kg 布比卡因。
- 术后护理
- 当皮肤切口闭合时，逐渐让动物脱离呼吸机。在断开动物与麻醉设备的连接之前，确保动物能够自主呼吸并保护反射。
- 确认动物能够保护其气道后拔出气管插管。用嵌入抗生素软膏的无菌和非粘附敷料覆盖皮肤切口，以尽量减少手术部位感染。
- 每 15 分钟继续监测生命体征，包括心率、呼吸频率、体温，直到动物能够在没有帮助的情况下保持姿势。
- 确保动物在能够抬起并抬起头并可以在没有帮助的情况下站立之前不会无人看管。在将动物运送到恢复病房之前，通过皮下途径以 0.2 mg/kg 的剂量给予美洛昔康。
- 当动物稳定时，将动物运送到恢复单位。将手术部位敷料保留在切口上，直到术后第 3 天。如果敷料变脏，请更换敷料。
- 在手术后的前 5 天内继续监测动物的疼痛程度、皮肤切口和整体健康状况。根据需要给予半剂量的美洛昔康（0.1 mg/kg），每日一次，用于突破性疼痛。
- 手术后的前 5 天，在切口愈合时将动物单独饲养，以降低手术部位被另一只动物感染的风险。5天后将动物送回集体饲养。
- 向兽医或适当的工作人员报告动物状况的任何并发症或变化（发烧、腹水、体重减轻、食欲不振等）。
3. 使用股骨通路的冠状动脉造影
- 将动物固定在手术台上的背卧位上。以每分钟 10-15 次呼吸的速度开始机械通气。根据需要将氧气设置为 2-4 L/min，将异氟醚设置为 1% 和 4%，以维持深度麻醉。
- 将心电图导联放在动物的肢体上以监测心律。评估动物的麻醉深度。考虑在没有眼睛或下颌反射时深度麻醉的动物。
- 用聚维酮碘磨砂膏清洁胸部和颈部区域，然后用毛巾覆盖动物。
- 通过手术切除进入股动脉，暴露股动脉和静脉。用 11 号刀片在股动脉中做一个 1-2 毫米的纵向切口，并使用血管腔中的 11 Fr 引入器鞘插管动脉。
- 获得通路后，推进导管进行冠状动脉造影，以评估 LIMA-LAD 移植物的解剖通畅性。
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Representative Results
血运重建后，进行冠状动脉造影以评估LAD狭窄（大于80%）和LIMA-LAD移植物的通畅性（图1）。血运重建手术和放置富含外泌体的胶原蛋白贴片 4 周后，使用低剂量多巴酚丁胺输注以 5μg/kg/min 的速度进行心脏 MRI 以评估心脏在静息和压力下的收缩和舒张功能。通过测量壁厚百分比（收缩期末壁厚 - 舒张期末壁厚）来分析收缩功能。通过测量舒张末期容量的峰值充盈率（PFR/EDV; 图2）。进行延迟造影剂成像以确认 LAD 区域没有心肌梗死。如果 LAD 区域存在梗死，则可能是由于蜼窄器引起的血栓形成继发于动脉闭塞所致。没有局部壁运动异常表明缺乏冬眠表型。
与对照组相比，在低剂量多巴酚丁胺输注下，HIB动物表现出舒张功能显着下降，通过PFR/EDV测量（分别为5.5±0.8和6.9±1.5，p < 0.05）。与HIB组相比，CABG组的PFR/EDV有改善的趋势（分别为6.3±0.9和5.5±0.8，p=0.06）。然而，与 HIB 组相比，CABG + MSC 组的 PFR/EDV 显着增加（分别为 6.6 ± 1.1 和 5.5± 0.8，p = 0.03; 图3）。心脏 MRI 用于确认左乳内动脉 （LIMA） 与左前降支 （LAD） 狭窄区域远端移植物旁路移植物缺乏坏死和通畅18。
在静息时，与单独使用CABG相比，CABG + MSC组不会改变区域收缩功能（通过壁厚百分比测量）（26.3%±7.0% vs. 34.9%±6.3%;p = 0.19）。在压力下，与单独使用CABG相比，CABG+MSC组的区域收缩功能有显著改善（78.3%±19.6%对39.2%±5.6%;p = 0.05）12 （图4）。
在尸检时，使用适当尺寸的冠状动脉扩张器来确保 LAD 狭窄和 LIMA 通畅。对心肌进行全面检查，以确保所有区域都存在组织活力，尤其是在缺血区域。三苯基氯化四氮唑 （TTC） 染色证实无疤痕。
图 1.显示解剖结构的心脏血管造影。 冠状动脉造影显示近端 LAD 动脉狭窄 >80% 和 LIMA-LAD 移植物吻合未闭。缩写： LIMA= 左乳内动脉， LAD= 左前降 请点击这里查看此图的较大版本.
图2.使用心脏 MRI 评估舒张、整体收缩功能和生存能力。 （A） 舒张松弛：心动周期中左心室 （LV） 容积的关系。x 轴是以 s 为单位的时间;y 轴是左心室的容积，单位为 mL。红线表示峰值填充率（LV 增加体积的最快速度）。PFR 归一化为动物的舒张末期容积 （PFR/EDV），以考虑动物之间的大小差异。（B） 整体收缩功能：心动周期期间的节段性环形应变（循环应变）（x 轴：时间单位为 ms;y 轴：与舒张末期测量值相比，左心室节段圆周长度的百分比变化）。峰值圆周应变由循环的最负值表示。（C） LAD 分布的代表性心脏 MRI 图像：LAD 分布以红色突出显示，代表前隔壁。在 4 腔室 （D） 长轴和 （E） 短轴视图上，没有基于增强的钆对比度的梗死证据。缩写：LV=左心室/心室;LAD=左前降;MRI=磁共振成像。这个数字是从 6修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3.峰值充盈率/舒张末期容积的 MRI 评估。 比较了四组（对照组、HIB、CABG 和 CABG + MSC）的舒张功能，通过 PFR/EDV 测量。在休息时，PFR/EDV 在四个动物组中具有可比性。然而，在低剂量多巴酚丁胺输注（5μg/kg/min）的应激下，与对照组相比，HIB组的PFR/EDV显著降低（p < 0.05），CABG组有改善趋势（p = 0.06），CABG组+MSC组显著增加（p < 0.05）。采用单因素方差分析（ANOVA）检验进行统计分析。数据以平均值±标准差的形式呈现。 缩写：CABG=冠状动脉旁路移植术，PFR=峰值充盈率，EDV=舒张末期容积;MRI=磁共振成像，MSC=间充质干细胞，SD=标准差。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4.通过壁增厚评估区域收缩功能的 MRI 评估 %。 与假贴片相比，间充质干细胞贴片治疗显示区域心脏功能有所改善。（A） 与假手术 （n = 6） 相比，通过壁增厚百分比测量的区域收缩功能在静息时没有显着改善 MSC 贴片治疗 （n = 6）。（B）在使用低剂量多巴酚丁胺输注（5μg/kg/min）的压力下，与假动物相比，MSC贴剂治疗后区域收缩功能显着改善（P<.05）。使用Mann-Whitney检验进行统计分析。水平条表示平均标准差。*第<.05页。缩写：MSC=间充质干细胞。这个数字是从 12修改而来的。 请点击这里查看此图的较大版本.
附表1.程序概述和每个程序的时间表。请点击此处下载此文件。
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Discussion
本研究提出了第一个慢性缺血性心肌的猪模型，其中表明，在手术血运重建期间，用 MSC 衍生的外泌体负载胶原蛋白贴片治疗可在正性肌力刺激下恢复舒张和收缩功能，可能通过靶向线粒体恢复。先前，研究表明，在HIB的大型动物模型中，通过心脏MRI测量的舒张和收缩功能仍然受损，并且仅随着血运重建而略有改善，而没有完全恢复6,19。尽管左心室射血分数保留，但功能障碍仍发生。这些发现准确地模拟了慢性缺血性心肌患者在左心室功能保留的单血管区域内的临床经验。
血运重建手术中存在一些关键和技术挑战，尤其是在既往开胸手术的情况下。胸骨进入时心血管损伤是一种风险，因为心包已经破裂并且可能存在粘连。胸骨切开术可能因靠近或粘附于胸骨而引起心脏损伤。这种风险可以通过使用摆动锯来减轻，这已被证明可以促进胸骨平稳地再入。
获得成功的 CABG 的一个关键方面是移植质量。一丝不苟的 LIMA 收获是成功进行高质量 CABG 的重要技术方面，并且与改善移植物通畅有关。LIMA可以使用两种技术收获：带蒂和镂空。椎弓根技术包括从胸骨解剖 LIMA 及其静脉、筋膜、脂肪和淋巴管。镂空化技术包括解剖 LIMA 而不去所有周围组织，因此仅产生20 条动脉。在该模型中，实施了骨架化技术，因为它可以最大限度地减少胸骨缺血，并且移植物比带蒂的 LIMA20 更长。LIMA 是一种精致的结构，任何过度拉伸、夹紧或错位夹子都可能导致血管损伤和不满意的结果。在解剖过程中，应谨慎使用烧灼尖端，并在低电压下使用。当将动脉与其穿孔分支分开时，使用血漏夹住分支的LIMA侧。必须注意不要烧灼夹子，因为这会导致导管变窄。在移植前确认脉动流动。
确保保持合理量的麻醉剂和麻痹剂，以尽量减少手术过程中的运动，尤其是在缝合吻合口时。使用适当剂量的利多卡因和肝素（200-300 单位/千克）分别消除心律失常和血栓形成的风险至关重要。如果动物在手术过程中出现任何心律失常，可能需要第二剂利多卡因。使用股动脉导管可进行连续血流动力学监测。进行吻合时，将 1-2 块手术海绵放在心脏后面或在心包两侧缝合以向上抬起左心室是有用的。在这个模型中，我们使用硅橡胶胶带和组织稳定剂，利用吸力有效地固定目标部位。放置稳定器并抬起心脏后，心电图上的动脉血压轻度下降和ST段压低。这些血流动力学紊乱通常耐受性良好，无需任何干预。在血流动力学不稳定明显的情况下，可以通过静脉途径给予一定剂量的去氧肾上腺素（5-20μg/ kg）以提高动脉血压。如果血流动力学不稳定危及生命，可通过静脉途径给予一定剂量的肾上腺素（0.1μg/kg;稀释度为1：10,000）作为紧急急救药物。一旦用海狸刀片暴露 LAD，就用 11 刀片进行动脉切开术，并用显微外科剪刀完成。在此操作过程中，必须注意不要伤害 LAD 的后壁。在非体外循环 CABG 期间保持动脉切开部位无血以允许准确缝合至关重要，并且已经描述了几种技术，包括用盐水溶液间歇冲洗、使用 CO2 鼓风机和腔内冠状动脉分流术21。在这项研究中，使用了 CO2 鼓风机和适当尺寸的腔内冠状动脉分流器，因为两者都常规用于非体外循环 CABG 操作。CO2 喷雾式鼓风机的一个潜在致命并发症是空气栓塞。然而，使用冠状动脉分流术可以消除空气栓塞的风险，冠状动脉分流术可以作为动脉切开术内的物理屏障。此外，冠状动脉分流术的使用有助于保持手术区域不流血，从而允许使用较低的气流并进一步降低空气栓塞的风险。分流器还提高了吻合的技术精度，并防止在缝合时无意中损伤动脉后壁22.
在这种成熟的猪模型中，在 CABG 手术期间采用了非体外循环而不是体外循环技术。使用这种技术而不是在泵上的优点是最大限度地减少手术时间，并避免主动脉和右心房的中央插管和完全肝素化。此外，它通过降低术后出血和/或心颞压的风险，有助于动物在手术后更快地恢复。这些是根据在开泵和离体外接受 CABG 的患者的临床经验推定的优势。
这种富含外泌体的胶原蛋白贴片是新颖的，因为它可以量化并通过手术固定到已经血运重建的缺血区域。这允许外泌体在几天内从贴片中持续释放，从而对缺血区域进行连续和直接的治疗。用 CABG 和外泌体治疗 4 周后冬眠组织的组织病理学显示心肌对贴片本身缺乏炎症反应，尽管在缝合部位注意到一些炎症，通过炎症细胞染色可以明显看出。虽然已经提出了多种方法将外泌体递送至心肌，但常见的技术（例如直接注射外泌体）导致治疗产品在受伤区域的滞留率低，因为高达 90% 的外泌体在注射后会冲走或分散23。注射后外泌体保留的分析已完成长达 3 小时，并显示外泌体含量显着降低24。外泌体易于分离，并且在长期储存条件下具有更大的灵活性，这为可用于急性环境的现成产品提供了机会，使其更容易转化为患者。
这项研究有几个局限性，包括动物的年龄和性别。考虑到手术和后勤方面的限制，以及动物福利法规和工作人员安全方面的考虑，只研究了幼年母猪。尽管 CABG 手术增加了模型的复杂性，但这是一项必需的干预措施，因为其他侵入性较小的干预措施（经皮冠状动脉介入治疗或 PCI）由于收缩的刚性而不允许打开 LAD 的狭窄区域18。此外，这种没有任何合并症的单血管狭窄模型并不能完全模拟人群中长期冠状动脉粥样硬化的程度和影响。未来的研究将侧重于通过手术将收缩器放置在回旋动脉和 LAD 上来使用冬眠心肌的多支血管疾病模型。然而，这种双血管疾病模型会导致心肌冬眠，射血分数降低。动物死亡率可能会增加，手术血运重建更加复杂，需要体外循环支持。将来，如果贴片类型的实际应用存在问题，将探索其他支架材料选择，例如脱细胞细胞外基质或替代形式的水凝胶。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国 （U.S.） 的 VA Merit Review #I01 BX000760 （RFK） 的支持。退伍军人事务部 BLR&D 和美国退伍军人事务部拨款 #I01 BX004146 （TAB）。我们也非常感谢明尼苏达大学利勒海心脏研究所的支持。本作品内容不代表美国政府退伍军人事务部的观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Ethibond | Ethicon | MG46G | Suture |
| # 40 clipper blade | Oster | 078919-016-701 | Remove hair from surgery sites |
| 0 Vicryl | Ethicon | J208H | Suture |
| 1 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1188100777 | Administer injectable agents |
| 1" medical tape | Medline | MMM15271Z | Secure wound dressing and IV catheters |
| 1000mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1324X | IV replacement fluid |
| 12 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881512878 | Administer injectable agents |
| 18 ga needles | BD | 305185 | Administration of injectable agents |
| 20 ga needles | BD | 305175 | Administration of injectable agents |
| 20 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881520657 | Administer injectable agents |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J317H | Suture |
| 250 mL 0.9% saline | Baxter | UE1322D | Replacement IV Fluid |
| 3 mL Syinge | Medtronic/Covidien | 1180300555 | Administer injectable agents |
| 3-0 Vicryl | Ethicon | VCP824G | Suture |
| 36” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX563 | Connect art. Line to transducer |
| 4.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43040 | Establish airway for Hibernation |
| 4-0 Tevdek II Strands | Deknatel | 7-922 | Suture to secure constrictor around LAD |
| 48” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX564 | Connect art. Line to transducer |
| 500mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1323Q | Drug delivery, Provide mist for Blower Mister |
| 6 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1180600777 | Administer injectable agents |
| 6.0 mm ID endotracheal tube | Mallinckrodt | 86049 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6.5 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43065 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6” pressure tubing line | Smith’s Medical | MX560 | Collect bone marrow |
| 60 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881560125 | Administer injectable agents |
| 7.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43070 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 7-0 Prolene | Ethicon | M8702 | Suture |
| Advanced DMEM (1X) | ThermoFisher Scientific | 12491023 | |
| Alcohol Prep pads | MedSource | MS-17402 | Skin disinfectant |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC910024 | |
| Anesthesia Machine | Drager | Fabious Trio | maintains general anesthesia |
| Anesthesia Machine + ventilator | DRE Drager- Fabius Tiro | DRE0603FT | Deliver Oxygen and inhalant to patient |
| Anesthesia Monitor | Phillips Intellivue | MP70 | Multiparameter for patient safety |
| Arterial Line Kit | Arrow | ASK-04510-HF | Femoral catheter for blood pressure monitoring |
| Artificial Tears | Rugby | 0536-1086-91 | Lubricate eyes to prevent corneal drying |
| Bair Hugger | 3M | Model 505 | Patient Warming system |
| Basic pack | Medline | DYNJP1000 | Sterile drapes and table cover |
| Blood Collection Tubes- green top | Fisher Scientific | 02-689-7 | Collect microsphere blood samples |
| Blower Mister Kit | Medtronic/Covidien | 22120 | Clears surgical field for vessel anastomosis |
| BODIPY TR Ceramide | ThermoFisher Scientific | D7540 | |
| Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle | Vidacare | 9001-VC-005 | Collect bone marrow |
| Bone Wax | Medline | ETHW31G | Hemostasis of cut bone |
| Bovie Cautery hand piece | Covidien | E2516 | Hemostasis |
| Bupivicaine | Pfizer | 00409-1161-01 | Local Anesthetic |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Sigma Aldrich | B9275 | Pre operative Analgesic for survivial procedures |
| Cell Scrapers | Corning | 353085 | |
| Cephazolin 1 gr | Pfizer | 00409-0805-01 | Antibiotic |
| Chest Tube | Covidien | 8888561043 | Evacuates air from chest cavity |
| Cloroprep | Becton Dickenson | 260815 | Surgical skin prep |
| CPT tube | BD | 362753 | MSC isolation from bone marrow |
| Delrin Constrictor | U of MN | Custom made | Creates stenosis of LAD |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Skin adhesive |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430062 | |
| Dobutamine 12.5 mg/mL | Pfizer | 00409-2344-01 | Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection |
| ECG Pads | DRE | 1496 | Monitor heart rhythm |
| Exosome-Depleted FBS | ThermoFisher Scientific | A2720801 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| Femoral and carotid introducer | Cordis- J&J | 504606P | femoral and carotis cannulas |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS | ThermoFisher Scientific | 16140089 | |
| Flo-thru 1.0 | Baxter | FT-12100 | used to anastomos LIMA to L |
| Flo-thru 1.25 | Baxter | FT-12125 | FT-12125 |
| Flo-thru 1.5 | Baxter | FT-12150 | FT-12150 |
| Flo-thru 2.0 | Baxter | FT-12200 | FT-12200 |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Clipper | Oster | 078566-011-002 | Remove hair from surgery sites |
| Helistat collagen sponge | McKesson | 570973 1690ZZ | Sponge for embedding exosomes |
| Heparin | Pfizer | 0409-2720-03 | anticoaggulant |
| Histology Jars | Fisher Scientific | 316-154 | Formalin for tissue samples |
| HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30071.03 | |
| Hypafix | BSN Medical | 4210 | Secure wound dressing and IV catheters |
| Isoflurane | Sigma Aldrich | CDS019936 | General Anesthestic- Inhalant |
| IV Tubing for Blower Mister | Carefusion | 42493E | Adapts to IV Fluids for Blower/Mister |
| Jelco 18 ga IV catheter | Smiths medical | 4054 | IV access in Revasc, MRI and Term |
| Lidocaine 2% | Pfizer | 00409-4277-01 | Local Anesthetic/ antiarrthymic |
| Ligaclips | Ethicon | MSC20 | Surgical Staples for LIMA takedown |
| Long blade for laryngoscope | DRE | 12521 | Allows for visualization of trachea for intubation |
| Meloxicam 5 mg/mL | Boehringer Ingelheim | 141-219 | Post operative Analgesic |
| Microsphere pump | Collect blood samples from femoral introducer | ||
| Monopolar Cautery | Covidien | Valleylab™ FT10 | Hemostasis |
| Nanosight NS 300 | Malvern Panalytical | MAN0541-03-EN | |
| NTA 3.1.54 software | Malvern Panalytical | MAN0520-01-EN-00 | |
| OPVAC Synergy II | Terumo Cardiovascular System | 401-230 | Heart positioner and Stabilizer |
| Oxygen Tank E cylinder | various | various | Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter |
| PBS, pH 7.2 | ThermoFisher Scientific | 20012050 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | ThermoFisher Scientific | 15640055 | |
| Pigtail 145 catheter 6 French | Boston Scientific | 08641-41 | Measure LV pressures |
| Pressure Transducer | various | Must adapt to anesthesia monitor | Monitor direct arterial pressures |
| Propofol | Diprivan | 269-29 | Induction agent |
| Roncuronium | Mylan | 67457-228-05 | Neuromuscular blocking agent |
| SR Buprenorphine 10 mg/mL | Abbott Labs | NADA 141-434 | Post operative Analgesic |
| Sterile Saline 20 mL | Fisher Scientific | 20T700220 | Flush for IV catheters |
| Sternal Saw/ Necropsy Saw | Thermo Fisher | 812822 | Used to open chest cavity |
| Stop Cocks | Smith Medical | MX5311L | 2 to connect to pig tail |
| Succinylcholine 20 mg/mL | Pfizer | 00409-6629-02 | Neuromuscular blocking agent |
| Suction tubing | Medline | DYND50223 | |
| Suction Container | Medline | DYNDCL03000 | |
| Surgery pack with chest retractor | various | See pack list | Femoral cut down and median sternotomy |
| Surgical Instruments | various | See pack list | Femoral and carotid cutdowns and sternotomy |
| Surgical Spring Clip | Applied Medical | A1801 | Clamp end of LIMA after takedown |
| Syringe pump | Harvard | Delivers IV Dobutamine infusion | |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Millipore Sigma | S32703 | |
| Telazol 100 mg/mL | Fort Dodge | 01L60030 | Pre operative Sedative |
| Telpha pad | Covidien | 2132 | Sterile wound dressing |
| Timer | Time collection of blood samples | ||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher Scientific | 4478359 | |
| TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE | ThermoFisher Scientific | TP90076 | |
| Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 23734 | Topical over wound |
| Vicryl mesh | Ethicon | VKML | Patch for epicardial cell application |
| Vortex | Mix microspheres | ||
| Xylazine 100 mg/mL | Vedco | 468RX | Pre operative Sedative/ analgesic |
References
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