Summary
Denna studie presenterar en kirurgisk svinmodell av kronisk myokardischemi på grund av progressiv kranskärlsstenos, vilket resulterar i nedsatt hjärtfunktion utan infarkt. Efter ischemi genomgår djuren kranskärlsbypasstransplantation med epikardiell placering av exosomfyllda kollagenplåster som härrör från stamceller. Denna tilläggsbehandling förbättrar hjärtmuskelfunktionen och återhämtningen.
Abstract
Kronisk myokardischemi till följd av progressiv kranskärlsstenos leder till vilande myokardium (HIB), definierat som myokardium som anpassar sig till minskad syretillgänglighet genom att minska metabolisk aktivitet, vilket förhindrar irreversibel kardiomyocytskada och infarkt. Detta skiljer sig från hjärtinfarkt, eftersom HIB har potential för återhämtning med revaskularisering. Patienter med betydande kranskärlssjukdom (CAD) upplever kronisk ischemi, vilket gör att de riskerar att drabbas av hjärtsvikt och plötslig död. Det vanliga kirurgiska ingreppet för svår kranskärlsoperation är kranskärlskirurgi (CABG), men det har visat sig vara en ofullständig behandling, men det finns inga kompletterande terapier för att återställa myocyter som är anpassade till kronisk ischemi. För att åtgärda denna lucka användes en kirurgisk modell av HIB med gris som är mottaglig för kranskärlssjukdom och efterliknar det kliniska scenariot. Modellen innebär två operationer. Den första operationen innebär att man implanterar en 1,5 mm stel konstriktor på vänster främre nedåtgående artär (LAD). När djuret växer orsakar sammandragningen gradvis betydande stenos som resulterar i nedsatt regional systolisk funktion. När stenosen når 80 % försämras myokardflödet och funktionen, vilket skapar HIB. En kranskärlsoperation utförs sedan med vänster inre bröstartär (LIMA) för att revaskularisera den ischemiska regionen. Djuret återhämtar sig under en månad för att möjliggöra optimal myokardförbättring före avlivning. Detta möjliggör fysiologiska och vävnadsstudier av olika behandlingsgrupper. Denna djurmodell visar att hjärtfunktionen förblir nedsatt trots kranskärlssjukdom, vilket tyder på behovet av nya kompletterande interventioner. I denna studie utvecklades ett kollagenplåster inbäddat med mesenkymala stamceller (MSC)-härledda exosomer, som kan appliceras kirurgiskt på epikardiell yta distalt om LIMA-anastomos. Materialet överensstämmer med epikardiet, är absorberbart och utgör byggnadsställningen för fördröjd frisättning av signalfaktorer. Denna regenerativa terapi kan stimulera myokardåterhämtning som inte svarar på enbart revaskularisering. Denna modell översätts till den kliniska arenan genom att tillhandahålla metoder för fysiologiska och mekanistiska utforskningar av återhämtning vid HIB.
Introduction
Globalt drabbar allvarlig kranskärlssjukdom över hundra miljoner patienter, och även om dödligheten har minskat är det fortfarande en av de främsta dödsorsakerna 1,2. CAD har ett brett kliniskt spektrum från hjärtinfarkt (MI) till ischemi med bevarad livsduglighet. Den mesta prekliniska forskningen fokuserar på hjärtinfarkt, som kännetecknas av förekomst av infarktvävnad som det är möjligt att studera i små och stora djurmodeller. Den modellen tar dock inte hänsyn till patienter med bevarad livsduglighet och som är mottagliga för revaskularisering. De flesta patienter som genomgår kranskärlskirurgi har nedsatt blodtillförsel och begränsad funktion samtidigt som variabiliteten i kontraktil reserv och viabilitet bibehålls3. Utan behandling kan dessa patienter utvecklas till avancerad hjärtsvikt och plötslig död, särskilt vid ökad arbetsbelastning4. Bland dessa patienter är kranskärlsoperation (CABG) en effektiv behandling men leder kanske inte till fullständig funktionell återhämtning5. Det är viktigt att notera att diastolisk dysfunktion, som är en markör för sämre kliniska resultat, inte återhämtar sig efter revaskularisering, vilket tyder på behovet av nya adjuvanta terapier under kranskärlssjukdom 6,7. För närvarande finns det inga kliniskt tillgängliga adjuvanta interventioner som används med kranskärlskirurgi för att återställa kardiomyocyter till full funktionell kapacitet. Detta är en stor terapeutisk lucka med tanke på att många patienter utvecklas till avancerad hjärtsvikt trots lämplig revaskularisering8.
En innovativ svinmodell av kronisk myokardiell ischemi som är mottaglig för kranskärlskirurgi, för att efterlikna klinisk CAD-erfarenhet, skapades9. Svin är en bra modell för hjärtsjukdom jämfört med andra stora djur eftersom de inte har epikardiella överbryggande kollateraler, så stenos i enbart LAD resulterar i regional ischemi10. I denna studie användes 16 veckor gamla Yorkshire-lantrasgrisar. I denna modell revaskulariserades LAD med kranskärlskirurgi utanför pumpen med hjälp av det vänstra inre bröstartärtransplantatet (LIMA) (tilläggstabell 1). Perkutan koronarintervention (PCI) är inte möjlig för att öppna stenosen eftersom sammandragningen är en stel anordning. Magnetisk resonanstomografi av hjärtat (MRT) används för att bedöma global och regional funktion, kranskärlsanatomi och vävnadsviabilitet. Hjärt-MRT-analys visade att den diastoliska funktionen, som kännetecknas av maximal fyllnadsgrad (PFR), förblir nedsatt trots kranskärlssjukdom6. Mekanismen för diastolisk dysfunktion relaterar sannolikt till försämrad mitokondriell bioenergetik och kollagenbildning vid HIB som kvarstår efter kranskärlssjukdom11.
Mesenkymala stamceller (MSC) ger terapeutisk signalering genom exosomer för att förbättra myokardiell återhämtning när de appliceras under kranskärlssjukdom. I denna svinmodell och parallella in vitro-studier visades att placering av ett epikardiellt MSC-vikrylplåster under kranskärlskirurgi återställer kontraktil funktion med ökning av viktiga mitokondriella proteiner, nämligen PGC-1α12, en viktig regulator för mitokondriell energimetabolism13. In vitro-modellen gjorde det möjligt för oss att undersöka MSC:s signaleringsmekanism på nedsatt mitokondriell funktion. Exosomer utsöndras stabila mikrovesiklar (50-150 nm) som innehåller protein eller nukleinsyror inklusive mikroRNA (miRNA)14. Nya in vitro-data tyder på att MSC-härledda exosomer är en viktig signalmekanism som är nödvändig för återhämtning av mitokondriell andning.
Exosomer från stamceller är lovande kompletterande terapier eftersom de är lättillgängliga, kan produceras kommersiellt och saknar etiska konflikter. Med hänsyn till klinisk översättning skapades ett kollagenplåster inbäddat med MSC-härledda exosomer som kan sys kirurgiskt till myokardiumets viloläge. Det visades att det finns en fördröjd leverans av exosomer med hjälp av detta plåster och det ger en cellfri regenerativ terapi med parakrin signaleringsmekanism som riktar sig mot mitokondriell återhämtning och förbättrar mitokondriell biogenes15. Denna procedur ger den prekliniska modellen för att studera effekten av MSC-härledda terapier för att förbättra hjärtfunktionen genom att förbättra mitokondriell funktion och minska inflammation vid tidpunkten för revaskularisering och vända myocytanpassningarna till kronisk ischemi.
I denna studie visas en kirurgisk metod för kranskärlsförbränning med LIMA till LAD-anastomos för att kringgå området med proximal LAD-stenos som efterliknar standardbehandlingen för patienter med CAD. Som tilläggsbehandling med kranskärlssjukdom demonstrerades den kirurgiska appliceringen av MSC-härledd exosominbäddad kollagenplåster på den ischemiska regionen av myokardiet. Denna kirurgiska modell kan användas för att studera de fysiologiska reaktionerna på den parakrina effekten som ses med användning av ett exosomplåster samt de molekylära mekanismerna för återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) vid Minneapolis VA Medical Center och University of Minnesota har godkänt alla djurstudier. National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för användning och skötsel av försöksdjur följdes.
1. Isolering av mesenkymala stamceller samt beredning och karakterisering av exosomer
- Isolering av benmärgshärledda mesenkymala stamceller (MSC)
- Ta 30-50 ml steril benmärg från bröstbenet eller skenbenet på en 20 veckor gammal Yorkshire-lantrassvinhona. För att göra detta, för in en 25 mm 15G interosseös nål i bröstbenet eller skenbenet och dra upp provet i en 60 ml spruta med 10 ml heparin.
OBS: För ytterligare information om insamling av benmärg se Pittenger et al. och Hocum-Stone et al.12,16. - I korthet, passera benmärgsprovet genom en Vacutainer CPT-slang med heparin i 30 minuter vid 1800 x g.
- Ta bort buffy-beläggningen som innehåller de mononukleära cellerna och tvätta med Hanks balanserade saltlösning. Mononukleära pelletsceller genom centrifugering och återsuspendera i odlingsmedium (10 % fetalt bovint serum [FBS]).
- Överför de mononukleära cellerna till cellodlingskolvar för vidhäftande tillväxt. Isolera MSC från den mononukleära fraktionen genom deras vidhäftande natur.
- Tvätta alla icke-MSC inom 24 timmar och lämna ett monolager av MSC i vävnadsodlingskolven. Bekräfta MSC-fenotypen genom flödescytometri, vilket säkerställer negativitet för CD45, en hematopoetisk markör, och positivitet för CD90 och CD105, markörer för MSC.
- Ta 30-50 ml steril benmärg från bröstbenet eller skenbenet på en 20 veckor gammal Yorkshire-lantrassvinhona. För att göra detta, för in en 25 mm 15G interosseös nål i bröstbenet eller skenbenet och dra upp provet i en 60 ml spruta med 10 ml heparin.
- Framställning och karakterisering av exosomer från mesenkymala stamceller från svin
- Frö 1 x 104 H9C2 råttkardiomyocyter och odling i 1x DMEM+ 10% FBS och 1x Pen/streptokocker. Frö 2 x 104 gris MSC i avancerad DMEM + 5% FBS och 1x Pen/streptokocker.
- När båda cellinjerna är minst 80 % konfluenta, byt ut mediet till exosomutarmade H9C2- och MSC-medier.
- Utsätt H9C2-kardiomyocyter för mild hypoxi (1 %O2 under 24 timmar). Ta bort kolvarna från hypoxi efter 24 timmar och pipettera ut H9C2-mediet.
- Ta bort och kassera MSC-mediet från MSC-kolven. Tillsätt renat H9C2-medium till MSC-kolven. Inkubera kolven i 6 timmar under normala förhållanden (5 % CO2 %, 20 % O2 och 37 ° C).
- Extrahera exosomerna från det samodlade konditionerade mediet med hjälp av reagenset för total exosomisolering enligt tillverkarens instruktioner.
- Verifiera identifieringen av exosomer genom western blot-detektion av vanliga exosomala proteiner med antikroppar mot CD-63 (1:1000)17.
- Utföra nanopartikelspårningsanalys (NTA) för att kvantifiera exosomerna och bedöma nanopartiklarnas storlek och fördelning. För att göra detta, lös upp totalt protein (50 μg) av exosomer i 500 μL PBS för att bestämma koncentrationen och storleksfördelningen av exosomer med hjälp av nanopartikelspårningsanalysator.
- Analysera data med hjälp av programvara för spårning av nanopartiklar.
2. Av pumpen kranskärlsoperation
- Beredning av djur
- Väg djuret (16 veckor gamla Yorkshire-lantrasgrisar) 3 dagar före planerad operation. Fasta djuret i 12 timmar före operationen samtidigt som det har tillgång till vatten under fastan.
- Ge buprenorfin 0,18 mg/kg intramuskulärt 2-4 timmar före operation.
- Induktion av djuret
- Söva djuret genom att ge en intramuskulär injektion av 6,6 mg/kg tiletamin-zolazepam/xylazin.
- Vänta i 15 minuter för att säkerställa adekvat sedering genom att bedöma käktonen följt av 22G-kateterplacering i den centrala öronvenen.
OBS: En annan perifer ven kan övervägas (t.ex. cefalisk ven) om öronvenen är otillräcklig. - Administrera oftalmisk salva lokalt i varje öga. Administrera 1-2 mg/kg propofol intravenöst för att inducera generell anestesi. Käktonen återspeglar på ett mest tillförlitligt sätt anestesidjupet och bör bedömas under hela ingreppet.
- Intubera djuret med en endotrakealtub av lämplig storlek.
- Kirurgi
- Raka bröstbenet och ljumsken på djuret som förberedelse för ett kirurgiskt ingrepp.
- Ställ in mekanisk ventilation på 10-15 andetag per minut, syrgas 1-4 l/min och isofluran 1,0-3,0 % efter behov för att bibehålla djup anestesi inför operationen. Kontrollera om det finns frånvarande ögon- eller käkreflex för att bekräfta djup anestesi.
- Positionsövervakningsutrustning (elektrokardiogram, sluttidal CO2 -, hjärtfrekvens, syremättnad, blodtryck och temperatur) på djuret.
- Anslut IV-katetern till en påse med vanlig koksaltlösning eller laktatlösning för att administrera underhållsvätskor kontinuerligt.
- Förbered huden med aseptisk teknik med povidonjodskrubb och lösning 3x för adekvat sterilitet och för att minimera risken för infektion i operationsområdet.
- Ge lidokain intravaskulärt (laddningsdos på 2 mg/kg eller kontinuerlig infusion på 50 μg/kg/min) för att förebygga arytmier.
- Placera djuret dorsalt och drapera med sterila handdukar.
- Utför antingen vänster eller höger lårbensartärskärning för placering av artärlinjen med Seldinger-teknik följt av att ansluta katetern till givaren för kontinuerlig blodtrycksövervakning vid operationstillfället.
- Använd monopolär diatermi för att göra ett 20 cm snitt som sträcker sig från bröstbensskåran proximalt ner till xyfoidprocessen distalt, och för att snitta lager av muskler, subkutant fett och bindväv ner till bröstbenet.
- Utför mediansternotomi med hjälp av oscillerande såg.
OBS: Standardsåg undviks för upprepad sternotomi eftersom det medför högre risk för myokardskada från tidigare perikardiella sammanväxningar från vänster torakotomiprocedur som gjorts för att placera LAD-sammandragningen. - Dela den bakre bröstplattan med en sax. Använd en specialiserad bröstkorgsretraktor för adekvat visualisering av mediastinum.
- Dissekera vidhäftningar med antingen monopolär diatermi eller Metzenbaum-saxen. Dissekera försiktigt den peristernala muskeln och fettet för att exponera den vänstra inre bröstartären (LIMA).
- När LIMA exponeras lateralt mot bröstbenskanten, separera den försiktigt från bröstväggen med trubbig dissektion med diatermispets. Använd LIMA som ett skeletterat transplantat.
- Börja dissektionen på nivån för 3:e interkostalrummet. Höj försiktigt den vänstra sternala kanten för optimal visualisering.
- Använd försiktig dragning på adventitia för att exponera de arteriella och venösa grenarna av LIMA. Klipp lima-sidan av grenarna med hjälp av hemoklips och bränn bröstväggssidan av grenarna.
OBS: Försiktighet måste iakttas så att du inte bränner klämman på LIMA, eftersom detta kan orsaka förträngning av ledningen. - När ett initialt segment av LIMA har mobiliserats, fortsätt dissektionen proximalt mot nivån av subclavian ven och distalt fram till LIMA-förgreningen.
- När dissektionen är avslutad, administrera heparin intravenöst i en dos på 100-300 E/kg. Vänta i 3 minuter efter att heparinet har administrerats.
- Efter 3 minuter klipper du den distala änden av LIMA, strax före nivån för LIMA-förgreningen, och delar ledningen. Sy den distala änden med en fri 2-0 silkessuturslips.
- Förbered den proximala änden för ympning. Inspektera flödeskvaliteten visuellt genom att låta transplantatet blöda i några sekunder.
- Kläm försiktigt fast den distala änden av LIMA-ledningen med en atraumatisk bulldog-klämma för att undvika blödning. Öppna hjärtsäcken med ett inverterat T och gör ett snitt på cirka 5-6 cm. Placera suturer i storlek 3-0 på hjärtsäcken för dragning på båda sidor av slitsen.
- Stabilisera LAD med silikonindragningstejp och vävnadsstabilisator, som är fäst vid sternalupprullningsdonet. Gör en arteriotomi i LAD-artären distalt om stenosen (orsakad av sammandragningsband) med ett 11-blad och förläng med en irissax.
- Placera en kransshunt av lämplig storlek i LAD. Utför LIMA till LAD-anastomos med 7-0 löpande icke-absorberbar sutur med hjälp av en bypass-teknik utanför pumpen. Släpp bulldoggens ockluderare på LIMA och bekräfta hemostasen.
- Beredning av mesenkymala stamceller (MSC)-härledda exosomplåster
- Efter framgångsrik isolering av exosomer från MSC, suspendera ungefär 3 x 108 exosomer i 3 ml normal saltlösning och tillsätt till kollagensvampen.
- Värm 3 ml exosomsuspension till rumstemperatur vid cirka 22 °C i 10 minuter. Lägg 2 absorberbara kollagesvampar (vardera 1,27 cm x 2,54 cm) i en medelstor petriskål.
- Använd en 5 ml spruta med en 18G nål för att försiktigt blanda exosomsuspensionen. Pipettera långsamt 1,5 ml suspension på varje kollagensvamp och vänta i 5 minuter för full absorption.
- Placering av exosomplåster
- Placera den exosomfyllda svampen upp och ner på hjärtats viloläge, som är epikardiet i den främre septumregionen i fördelningen av LAD.
- Placera försiktigt två svampar för att täcka hjärtats viloläge. Använd ett 3,5 cm x 1,0 cm polyglaktinnät för att täcka varje kollagensvamp.
- Sy fast nätet på epikardiet med fina 7-0 avbrutna suturer.
- Placering av thoraxdränage
- Placera ett thoraxdränage genom ett separat sticksnitt, nära den nedre delen av sternotomisnittet. Placera thoraxdränage försiktigt över hjärtats främre del.
- När tuben är på plats, placera en purse string sutur med 3-0 sutur med hjälp av en horisontell madrasssöm för att möjliggöra stängning av såret när röret tas bort.
- Thoraxdränage bibehålls tills bröstkorgen är helt stängd.
- Stängning av bröstet
- Approximera bröstbenet med icke-absorberbara suturer med hjälp av ett åttamönster. Administrera 1 mg/kg bupivakain intramuskulärt längs hela snittets längd.
OBS: Sutur används snarare än trådar för att undvika störningar vid MRT-avbildning. - Stäng lager av muskler och hud på vanligt sätt med 2-0 respektive 3-0 absorberbar sutur.
- Utför ett andningsuppehåll och sug för att evakuera all luft ut ur brösthålan. Övervaka luftvägstrycket på ventilatorn noggrant och håll trycket mellan 15-22 mmHg och släpp när det är klart.
- När all luft har evakuerats, ta bort thoraxdränageslangen samtidigt som du stänger såret med hjälp av pursesträngsuturen. Applicera lim lokalt för att täcka bröstsnittet.
- Approximera bröstbenet med icke-absorberbara suturer med hjälp av ett åttamönster. Administrera 1 mg/kg bupivakain intramuskulärt längs hela snittets längd.
- Postoperativ vård efter operation
- Avvänj djuret gradvis från respiratorn medan hudsnittet stängs. Se till att djuret kan andas spontant och skydda reflexer innan du kopplar bort djuret från anestesiutrustningen.
- Ta bort endotrakealtuben efter att ha bekräftat att djuret kan skydda sina luftvägar. Täck hudsnittet med sterilt och icke-vidhäftande förband inbäddat med antibiotikasalva för att minimera infektion i operationsområdet.
- Fortsätt att övervaka vitala tecken inklusive hjärtfrekvens, andningsfrekvens, kroppstemperatur var 15:e minut tills djuret kan hålla sin position utan hjälp.
- Se till att djuret inte lämnas utan uppsikt tills det kan lyfta och hålla upp huvudet och kan stå utan hjälp. Administrera meloxikam i en dos på 0,2 mg/kg subkutant innan djuret transporteras till återvinningsavdelningen.
- Transportera djuret till uppsamlingsenheten när djuret är stabilt. Behåll operationsförbandet på snittet fram till postoperativ dag 3. Byt ut förbandet om det blir smutsigt.
- Fortsätt att övervaka nivån på smärtan, hudsnittet och det allmänna välbefinnandet hos djuret under de första 5 dagarna efter operationen. Administrera en halv dos meloxikam (0,1 mg/kg) vid behov en gång dagligen för genombrottssmärta.
- Ensamma inhyser djuret under de första 5 dagarna efter operationen medan snittet/snitten läker för att minska risken för infektion av ett annat djur. Lämna tillbaka djuret till grupphållning efter 5 dagar.
- Rapportera eventuella komplikationer eller förändringar i djurets tillstånd (feber, ascites, viktminskning, aptitlöshet etc.) till veterinären eller lämplig personal.
3. Koronarangiografi med tillgång till lårbenet
- Fäst djuret på operationsbordet i ryggläge. Starta mekanisk ventilation med 10-15 andetag per minut. Ställ in syrgasen på 2-4 l/min, isofluran på 1 % och 4 %, efter behov för att upprätthålla ett djupt anestesiplan.
- Placera EKG-kablar på djurets lem för att övervaka hjärtrytmen. Utvärdera djuret för anestesidjupet. Betrakta djuret som djupt bedövat när ögon- eller käkreflexen saknas.
- Rengör bröst- och halsområdet med povidonjodskrubb och drapera sedan djuret med handdukar.
- Åtkomst till lårbensartären via kirurgisk nedskärning och exponera lårbensartären och venen. Gör ett 1-2 mm längsgående snitt med ett blad nr 11 i lårbensartären och kannulera artären med hjälp av en 11 Fr introducerhylsa i kärllumen.
- Efter att ha fått åtkomst, för fram katetern för att utföra kranskärlsröntgen för att bedöma anatomipatencyen hos LIMA-LAD-transplantatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter revaskularisering utförs kranskärlsröntgen för att bedöma LAD-stenos (mer än 80 %) och patency av LIMA-LAD-transplantatet (Figur 1). Fyra veckor efter revaskulariseringsoperationen och placeringen av det exosomladdade kollagenplåstret utförs hjärt-MRT för att bedöma hjärtats systoliska och diastoliska funktion i vila och under stress med hjälp av lågdos dobutamininfusion på 5 μg/kg/min. Systolisk funktion analyseras genom att mäta väggtjockleksprocent (väggtjocklek i slutet systole - väggtjocklek i slutet diastole). Diastolisk funktion analyseras genom att mäta toppfyllningshastighet över slutdiastolisk volym (PFR/EDV; Figur 2). Fördröjd kontrastavbildning utfördes för att bekräfta avsaknad av hjärtinfarkt i LAD-territoriet. Om en infarkt i LAD-regionen är närvarande beror det sannolikt på den ockluderade artären sekundärt till trombos orsakad av sammandragningen. Frånvaro av regionala väggrörelseavvikelser visar brist på vilande fenotyp.
Vid låga doser av dobutamininfusion uppvisar HIB-djur signifikant minskning av diastolisk funktion, mätt med PFR/EDV, jämfört med kontrollgruppen (5,5 ± 0,8 jämfört med 6,9 ± 1,5, p < 0,05). Kranskärlsgruppen visar en trend mot förbättring av PFR/EDV jämfört med HIB-gruppen (6,3 ± 0,9 jämfört med 5,5 ± 0,8, p = 0,06). CABG + MSC-gruppen visar dock en signifikant ökning av PFR/EDV jämfört med HIB-gruppen (6,6 ± 1,1 jämfört med 5,5± 0,8, p = 0,03; Figur 3). Hjärt-MRT användes för att bekräfta avsaknad av nekros och genomsläpplighet av vänster inre bröstartär (LIMA) till vänster främre nedåtgående artär (LAD) bypass-transplantat distalt om området för stenos18.
I vila förändrar CABG + MSC-gruppen inte den regionala systoliska funktionen (mätt i procentuell väggtjocklek) jämfört med enbart CABG (26,3 % ± 7,0 % jämfört med 34,9 % ± 6,3 %; p = 0,19). Under stress uppvisar CABG + MSC-gruppen signifikant förbättring av regional systolisk funktion jämfört med enbart kranskärlskirurgi (78,3 % ± 19,6 % jämfört med 39,2 % ± 5,6 %; p = 0,05)12 (Figur 4).
Vid obduktion användes kranskärlsvidgare av lämplig storlek för att säkerställa LAD-stenos och LIMA-genomsläpplighet. Myokardium inspekterades noggrant för att säkerställa att vävnadens viabilitet finns i alla regioner, särskilt i den ischemiska regionen. Trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning bekräftad frånvaro av ärr.
Figur 1. Hjärtangiografi som visar anatomin. Koronarangiografi visar >80 % stenos av proximal LAD-artär och patenterad LIMA-LAD-transplantatanastomos. Förkortningar: LIMA= Vänster inre bröstartär, LAD= Vänster främre nedåtgående Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Bedömning av diastolisk relaxation, global kontraktil funktion och viabilitet med hjälp av hjärt-MRT. (A) Diastolisk avslappning: Förhållandet mellan vänster kammares (LV) volym under en hjärtcykel. X-axeln är tid i s; y-axeln är volymen av vänster kammare i ml. Den röda linjen indikerar maximal fyllnadshastighet (snabbast hastighet med vilken LV ökar volymen). PFR normaliseras till djurets slutdiastoliska volym (PFR/EDV) för att ta hänsyn till storleksvariation mellan djur. (B) Global kontraktil funktion: Segmentell perifer stam (Circ strain) under hjärtcykeln (x-axel: tid i ms; y-axel: procentuell förändring av perifer längd av vänster kammaresegment jämfört med slutdiastolisk mätning). Maximal perifer töjning representeras av det mest negativa värdet på cykeln. (C) Representativ MRT-bild av LAD-distribution: LAD-fördelningen är markerad med rött och representerar den anteroseptala väggen. Det fanns inga tecken på infarkt baserat på förstärkt gadoliniumkontrast på 4 kammare (D) långaxel och (E) kortaxel. Förkortningar: LV= vänster kammare/kammare; LAD= vänster främre nedåtgående; MRT= magnetisk resonanstomografi. Denna siffra har ändrats från 6. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. MRT-bedömning av maximal fyllnadsgrad/diastolisk slutvolym. Diastolisk funktion, mätt med PFR/EDV, jämfördes mellan fyra grupper (Control, HIB, CABG och CABG + MSC). I vila är PFR/EDV jämförbar mellan fyra djurgrupper. Under stress med lågdos dobutamininfusion (5 μg/kg/min) visade HIB-gruppen en signifikant minskning av PFR/EDV jämfört med kontroll (p < 0,05) med trend mot förbättring i CABG-gruppen (p = 0,06) och signifikant ökning i CABG + MSC-gruppen (p < 0,05). Statistiska analyser utfördes med hjälp av envägsanalys av varianstest (ANOVA). Data presenteras som medel ± SD. Förkortningar: CABG= Kranskärlsbypass-graft, PFR= Maximal fyllnadshastighet, EDV= slut diastolisk volym; MRT= magnetisk resonanstomografi, MSC= mesenkymala stamceller, SD= standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. MRT-bedömning av regional systolisk funktion genom väggförtjockning %. Behandling med MSC-plåster visar förbättring av regional hjärtfunktion jämfört med skenplåster. (A) Regional systolisk funktion, mätt som väggförtjockningsprocent, förbättras inte signifikant i vila med MSC-plåsterbehandling (n = 6) jämfört med sham (n = 6). (B) Under stress med lågdos dobutamininfusion (5 μg/kg/min) ses en signifikant förbättring av den regionala systoliska funktionen efter behandling med MSC-plåstret jämfört med skendjur (P<,05). statistiska analyser utfördes med hjälp av Mann-Whitney-testet. Horisontella staplar anger genomsnittlig standardavvikelse. *P<,05. Förkortningar: MSC= Mesenkymala stamceller. Denna siffra har ändrats från 12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1. Översikt över förfaranden och tidsplan för varje förfarande. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie presenterar den första grismodellen av kroniskt ischemiskt myokardium, där det visades att behandling med ett MSC-härlett exosomladdat kollagenplåster under kirurgisk revaskularisering återställer diastolisk och systolisk funktion vid inotrop stimulering potentiellt genom att rikta in sig på mitokondriell återhämtning. Tidigare har det visats att i en stordjursmodell av hib förblir den diastoliska och systoliska funktionen, mätt med hjärt-MRT, nedsatt och förbättras endast något med revaskularisering utan fullständig återhämtning 6,19. Dysfunktionen uppstod trots bevarad ejektionsfraktion i vänster kammare. Dessa fynd efterliknar exakt den kliniska erfarenhet som setts hos patienter med kronisk ischemisk myokardium i ett enda kärlområde med bevarad vänsterkammarfunktion.
Det finns flera kritiska och tekniska utmaningar under revaskulariseringskirurgi, särskilt i samband med tidigare torakotomi. Kardiovaskulär skada vid sternal ingång är en risk eftersom hjärtsäcken redan har brutits och sammanväxningar kan förekomma. Sternotomi kan orsaka hjärtskada på grund av närhet eller vidhäftning till bröstbenet. Denna risk kan minskas genom att använda en oscillerande såg, som har visat sig främja ett händelselöst sternalt återinträde.
En viktig aspekt för att få en lyckad kranskärlsoperation är transplantatkvaliteten. Noggrann LIMA-skörd är en viktig teknisk aspekt för att framgångsrikt utföra kranskärlskärlskirurgi av hög kvalitet och är förknippad med förbättrad transplantatöppenhet. LIMA kan skördas med hjälp av två tekniker: pedicled och skeletonized. Pedikerad teknik inkluderar dissekering av LIMA från bröstbenet tillsammans med dess vener, fascia, fett och lymfatik. Skelettteknik inkluderar att dissekera LIMA fri från all omgivande vävnad, och därför ger artären endast20. I denna modell implementerades skeletteringstekniken eftersom den kan minimera sternal ischemi och transplantatet är längre än en pedicled LIMA20. LIMA är en känslig struktur, all onödig sträckning, klämning eller felplacerade klämmor kan resultera i kärlskador och otillfredsställande resultat. Under dissektion bör brännspetsen användas med försiktighet och vid låg volymtage. När artären separeras från dess perforerande grenar klipps LIMA-sidan av grenarna med hjälp av hemoklipser. Försiktighet måste iakttas så att du inte bränner klämmorna eftersom det kan leda till att ledningen smalnar av. Bekräfta pulserande flöde före ympning.
Se till att rimliga mängder anestesi och paralytika bibehålls för att minimera rörelsen under operationen, särskilt när du syr anastomosen. Det är viktigt att använda lämpliga doser av lidokain och heparin (200-300 enheter/kg) för att eliminera risken för arytmi respektive trombos. En andra dos lidokain kan vara indicerad om djuret får arytmier under operationen. Användning av lårbensartären möjliggör kontinuerlig hemodynamisk övervakning. När anastomosen utförs är det användbart att antingen sätta 1-2 kirurgiska svampar bakom hjärtat eller placera suturer på vardera sidan av hjärtsäcken för att lyfta vänster kammare uppåt. I den här modellen använder vi silastiska tejper och vävnadsstabilisatorn som använder sugtryck för att effektivt immobilisera målstället. En mild sänkning av arteriellt blodtryck utöver ST-depression på EKG kan noteras när stabilisatorn placeras och hjärtat lyfts. Dessa hemodynamiska rubbningar tolereras vanligtvis väl utan att kräva några ingrepp. I situationer där hemodynamisk instabilitet är signifikant kan en dos fenylefrin (5-20 μg/kg) intravenöst administreras för att höja det arteriella blodtrycket. Om hemodynamisk instabilitet är livshotande kan en dos adrenalin (0,1 μg/kg; utspädd 1:10 000) administreras intravenöst som ett akut akutläkemedel. När LAD exponeras med ett bäverblad utförs en arteriotomi med ett 11-blad och avslutas med en mikrokirurgisk sax. Man måste vara försiktig så att man inte skadar den bakre väggen i LAD under denna manöver. Det är viktigt att hålla arteriotomistället blodfritt under kranskärlsoperation utanför pumpen för att möjliggöra korrekt suturering och flera tekniker har beskrivits, inklusive intermittent spolning med koksaltlösning, användning av CO2-blåsare och intraluminal kransshunt. I denna studie användes CO2-blåsaren tillsammans med en intraluminal kransshunt av lämplig storlek eftersom båda rutinmässigt används vid kranskärlsoperationer utanför pumpen. En potentiellt dödlig komplikation av CO2 mister blower är en luftemboli. Risken för luftemboli kan dock motverkas genom att använda kranskärlsshunt, som kan fungera som en fysisk barriär i arteriotomin. Dessutom hjälper användningen av kranskärlsshunt till att hålla det kirurgiska fältet blodfritt, vilket möjliggör användning av ett lägre gasflöde och ytterligare minimerar risken för luftemboli. Shuntar förbättrar också den tekniska precisionen för anastomos och förhindrar oavsiktlig skada på artärens bakre vägg vid suturering22.
I denna väletablerade svinmodell användes en teknik utan pump i stället för med en pump vid kranskärlskirurgi. Fördelarna med att använda denna teknik, istället för on-pumpen, är att minimera operationstiden och undvika central kanylering av aorta och höger förmak med full heparinisering. Dessutom bidrar det till snabbare återhämtning av djuret efter operationen genom att minska risken för postoperativ blödning och/eller hjärttemponad. Detta är förmodade fördelar baserade på klinisk erfarenhet hos patienter som genomgår kranskärlskirurgi både på och utanför pumpen.
Detta exosomladdade kollagenplåster är nytt genom att det kan kvantifieras och kirurgiskt fästas till det område av ischemi som har revaskulariserats. Detta möjliggör fördröjd frisättning av exosomer från plåstret under flera dagar, vilket resulterar i kontinuerlig och direkt behandling av den ischemiska regionen. Histopatologi av den vilande vävnaden 4 veckor efter behandling med kranskärlssjukdom och exosom visade avsaknad av inflammatorisk respons av myokardium på själva plåstret, även om viss inflammation noterades på platsen för suturer, vilket framgår av färgning för inflammatoriska celler. Även om en mängd olika metoder har föreslagits för exosomtillförsel till hjärtmuskeln, resulterar vanliga tekniker som direkt injektion av exosom i låg retention av terapeutisk produkt i det skadade området, eftersom upp till 90 % av exosomerna tvättas bort eller sprids efter injektion23. Analys av exosomretentionen efter injektion har genomförts i upp till 3 timmar efter injektion och har visat signifikanta minskningar av exosominnehållet24. Exosomer är lätta att isolera och har mer flexibilitet när det gäller lagringsförhållanden under långa tidsperioder, vilket ger en möjlighet till standardprodukter som kan användas i den akuta miljön, vilket gör det mer översättbart till patienter.
Denna studie har flera begränsningar, bland annat djurens ålder och kön. Med tanke på kirurgiska och logistiska begränsningar, hänsyn till djurskyddsregler och personalens säkerhet, studerades endast unga svinhonor. Även om kranskärlskirurgi bidrar till modellens komplexitet var det ett nödvändigt ingrepp eftersom andra mindre invasiva ingrepp (perkutan koronarintervention eller PCI) inte skulle tillåta att öppna den stenotiska regionen av LAD på grund av den stela karaktären hos sammandragningen18. Dessutom simulerar denna modell av enkärlsstenos utan några komorbiditeter inte fullt ut omfattningen och effekterna av långvarig koronar ateroskleros som ses i den mänskliga populationen. Framtida studier kommer att fokusera på att använda en flerkärlssjukdomsmodell för viloläge genom att kirurgiskt placera sammandragningen på cirkumflexartären och LAD. Denna modell med två kärlsjukdomar skulle dock resultera i myokardium i viloläge med reducerad ejektionsfraktion. Djurdödligheten skulle sannolikt öka, och revaskularisering kirurgiskt är mer komplicerat och kräver bypass-stöd på pumpen. I framtiden, om det fanns problem med de praktiska tillämpningarna av plåstertyp, kommer andra alternativ för ställningsmaterial att undersökas, såsom decellulariserad extracellulär matris eller alternativ form av hydrogeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av VA Merit Review #I01 BX000760 (RFK) från USA (USA) Department of Veterans Affairs BLR&D och U.S. Department of Veterans Affairs grant #I01 BX004146 (TAB). Vi är också tacksamma för stödet från University of Minnesota Lillehei Heart Institute. Innehållet i detta arbete representerar inte åsikterna hos USA:s departement för veteranfrågor i USA:s regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Ethibond | Ethicon | MG46G | Suture |
| # 40 clipper blade | Oster | 078919-016-701 | Remove hair from surgery sites |
| 0 Vicryl | Ethicon | J208H | Suture |
| 1 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1188100777 | Administer injectable agents |
| 1" medical tape | Medline | MMM15271Z | Secure wound dressing and IV catheters |
| 1000mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1324X | IV replacement fluid |
| 12 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881512878 | Administer injectable agents |
| 18 ga needles | BD | 305185 | Administration of injectable agents |
| 20 ga needles | BD | 305175 | Administration of injectable agents |
| 20 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881520657 | Administer injectable agents |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J317H | Suture |
| 250 mL 0.9% saline | Baxter | UE1322D | Replacement IV Fluid |
| 3 mL Syinge | Medtronic/Covidien | 1180300555 | Administer injectable agents |
| 3-0 Vicryl | Ethicon | VCP824G | Suture |
| 36” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX563 | Connect art. Line to transducer |
| 4.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43040 | Establish airway for Hibernation |
| 4-0 Tevdek II Strands | Deknatel | 7-922 | Suture to secure constrictor around LAD |
| 48” Pressure monitoring tubing | Smith’s Medical | MX564 | Connect art. Line to transducer |
| 500mL 0.9% Sodium chloride | Baxter | 2B1323Q | Drug delivery, Provide mist for Blower Mister |
| 6 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 1180600777 | Administer injectable agents |
| 6.0 mm ID endotracheal tube | Mallinckrodt | 86049 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6.5 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43065 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 6” pressure tubing line | Smith’s Medical | MX560 | Collect bone marrow |
| 60 mL Syringe | Medtronic/Covidien | 8881560125 | Administer injectable agents |
| 7.0 mm ID endotracheal tube | Medline | DYND43070 | Establish airway for Revasc,MRI and Termination |
| 7-0 Prolene | Ethicon | M8702 | Suture |
| Advanced DMEM (1X) | ThermoFisher Scientific | 12491023 | |
| Alcohol Prep pads | MedSource | MS-17402 | Skin disinfectant |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC910024 | |
| Anesthesia Machine | Drager | Fabious Trio | maintains general anesthesia |
| Anesthesia Machine + ventilator | DRE Drager- Fabius Tiro | DRE0603FT | Deliver Oxygen and inhalant to patient |
| Anesthesia Monitor | Phillips Intellivue | MP70 | Multiparameter for patient safety |
| Arterial Line Kit | Arrow | ASK-04510-HF | Femoral catheter for blood pressure monitoring |
| Artificial Tears | Rugby | 0536-1086-91 | Lubricate eyes to prevent corneal drying |
| Bair Hugger | 3M | Model 505 | Patient Warming system |
| Basic pack | Medline | DYNJP1000 | Sterile drapes and table cover |
| Blood Collection Tubes- green top | Fisher Scientific | 02-689-7 | Collect microsphere blood samples |
| Blower Mister Kit | Medtronic/Covidien | 22120 | Clears surgical field for vessel anastomosis |
| BODIPY TR Ceramide | ThermoFisher Scientific | D7540 | |
| Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle | Vidacare | 9001-VC-005 | Collect bone marrow |
| Bone Wax | Medline | ETHW31G | Hemostasis of cut bone |
| Bovie Cautery hand piece | Covidien | E2516 | Hemostasis |
| Bupivicaine | Pfizer | 00409-1161-01 | Local Anesthetic |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Sigma Aldrich | B9275 | Pre operative Analgesic for survivial procedures |
| Cell Scrapers | Corning | 353085 | |
| Cephazolin 1 gr | Pfizer | 00409-0805-01 | Antibiotic |
| Chest Tube | Covidien | 8888561043 | Evacuates air from chest cavity |
| Cloroprep | Becton Dickenson | 260815 | Surgical skin prep |
| CPT tube | BD | 362753 | MSC isolation from bone marrow |
| Delrin Constrictor | U of MN | Custom made | Creates stenosis of LAD |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Skin adhesive |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430062 | |
| Dobutamine 12.5 mg/mL | Pfizer | 00409-2344-01 | Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection |
| ECG Pads | DRE | 1496 | Monitor heart rhythm |
| Exosome-Depleted FBS | ThermoFisher Scientific | A2720801 | |
| Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| Femoral and carotid introducer | Cordis- J&J | 504606P | femoral and carotis cannulas |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS | ThermoFisher Scientific | 16140089 | |
| Flo-thru 1.0 | Baxter | FT-12100 | used to anastomos LIMA to L |
| Flo-thru 1.25 | Baxter | FT-12125 | FT-12125 |
| Flo-thru 1.5 | Baxter | FT-12150 | FT-12150 |
| Flo-thru 2.0 | Baxter | FT-12200 | FT-12200 |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Clipper | Oster | 078566-011-002 | Remove hair from surgery sites |
| Helistat collagen sponge | McKesson | 570973 1690ZZ | Sponge for embedding exosomes |
| Heparin | Pfizer | 0409-2720-03 | anticoaggulant |
| Histology Jars | Fisher Scientific | 316-154 | Formalin for tissue samples |
| HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30071.03 | |
| Hypafix | BSN Medical | 4210 | Secure wound dressing and IV catheters |
| Isoflurane | Sigma Aldrich | CDS019936 | General Anesthestic- Inhalant |
| IV Tubing for Blower Mister | Carefusion | 42493E | Adapts to IV Fluids for Blower/Mister |
| Jelco 18 ga IV catheter | Smiths medical | 4054 | IV access in Revasc, MRI and Term |
| Lidocaine 2% | Pfizer | 00409-4277-01 | Local Anesthetic/ antiarrthymic |
| Ligaclips | Ethicon | MSC20 | Surgical Staples for LIMA takedown |
| Long blade for laryngoscope | DRE | 12521 | Allows for visualization of trachea for intubation |
| Meloxicam 5 mg/mL | Boehringer Ingelheim | 141-219 | Post operative Analgesic |
| Microsphere pump | Collect blood samples from femoral introducer | ||
| Monopolar Cautery | Covidien | Valleylab™ FT10 | Hemostasis |
| Nanosight NS 300 | Malvern Panalytical | MAN0541-03-EN | |
| NTA 3.1.54 software | Malvern Panalytical | MAN0520-01-EN-00 | |
| OPVAC Synergy II | Terumo Cardiovascular System | 401-230 | Heart positioner and Stabilizer |
| Oxygen Tank E cylinder | various | various | Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter |
| PBS, pH 7.2 | ThermoFisher Scientific | 20012050 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | ThermoFisher Scientific | 15640055 | |
| Pigtail 145 catheter 6 French | Boston Scientific | 08641-41 | Measure LV pressures |
| Pressure Transducer | various | Must adapt to anesthesia monitor | Monitor direct arterial pressures |
| Propofol | Diprivan | 269-29 | Induction agent |
| Roncuronium | Mylan | 67457-228-05 | Neuromuscular blocking agent |
| SR Buprenorphine 10 mg/mL | Abbott Labs | NADA 141-434 | Post operative Analgesic |
| Sterile Saline 20 mL | Fisher Scientific | 20T700220 | Flush for IV catheters |
| Sternal Saw/ Necropsy Saw | Thermo Fisher | 812822 | Used to open chest cavity |
| Stop Cocks | Smith Medical | MX5311L | 2 to connect to pig tail |
| Succinylcholine 20 mg/mL | Pfizer | 00409-6629-02 | Neuromuscular blocking agent |
| Suction tubing | Medline | DYND50223 | |
| Suction Container | Medline | DYNDCL03000 | |
| Surgery pack with chest retractor | various | See pack list | Femoral cut down and median sternotomy |
| Surgical Instruments | various | See pack list | Femoral and carotid cutdowns and sternotomy |
| Surgical Spring Clip | Applied Medical | A1801 | Clamp end of LIMA after takedown |
| Syringe pump | Harvard | Delivers IV Dobutamine infusion | |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Millipore Sigma | S32703 | |
| Telazol 100 mg/mL | Fort Dodge | 01L60030 | Pre operative Sedative |
| Telpha pad | Covidien | 2132 | Sterile wound dressing |
| Timer | Time collection of blood samples | ||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher Scientific | 4478359 | |
| TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE | ThermoFisher Scientific | TP90076 | |
| Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 23734 | Topical over wound |
| Vicryl mesh | Ethicon | VKML | Patch for epicardial cell application |
| Vortex | Mix microspheres | ||
| Xylazine 100 mg/mL | Vedco | 468RX | Pre operative Sedative/ analgesic |
References
- Dai, H., et al. Global, regional, and burden of ischaemic heart disease and its attributable risk factors, 1990-2017: results from the Global Burden of Disease Study 2017. European heart journal. Quality of care & clinical outcomes. 8 (1), 50-60 (2022).
- Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2022 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153-e639 (2022).
- Rahimtoola, S. H.
- Canty, J. M. Jr, Fallavollita, J. A.
- Page, B. J., et al. Revascularization of chronic hibernating myocardium stimulates myocyte proliferation and partially reverses chronic adaptations to ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 65 (7), 684-697 (2015).
- Aggarwal, R., et al. Persistent diastolic dysfunction in chronically ischemic hearts following coronary artery bypass graft. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (6), e269-e279 (2023).
- Olsen, F. J., et al. Prognostic Value and Interplay Between Myocardial Tissue Velocities in Patients Undergoing Coronary Artery Bypass Grafting. The American Journal of Cardiology. 144, 37-45 (2021).
- Virani, S. S. Heart Disease and Stroke Statistics-2021 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Hocum Stone, L., et al. Surgical Swine Model of Chronic Cardiac Ischemia Treated by Off-Pump Coronary Artery Bypass Graft Surgery. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (133), e57229 (2018).
- White, F. C., Carroll, S. M., Magnet, A., Bloor, C. M. Coronary collateral development in swine after coronary artery occlusion. Circulation Research. 71 (6), 1490-1500 (1992).
- Righetti, A., et al. Interventricular septal motion and left ventricular function after coronary bypass surgery: evaluation with echocardiography and radionuclide angiography. The American Journal of Cardiology. 39 (3), 372-377 (1977).
- Hocum Stone, L. L., et al. Recovery of hibernating myocardium using stem cell patch with coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 62 (1), e3-e16 (2021).
- Puigserver, P., Spiegelman, B. M. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha (PGC-1 alpha): transcriptional coactivator and metabolic regulator. Endocrine Reviews. 24 (1), 78-90 (2003).
- Henning, R. J. Cardiovascular Exosomes and MicroRNAs in Cardiovascular Physiology and Pathophysiology. Journal of Cardiovascular Translational Research. 14 (2), 195-212 (2021).
- Chen, Y., Liu, Y., Dorn, G. W. 2nd. Mitochondrial fusion is essential for organelle function and cardiac homeostasis. Circulation Research. 109 (12), 1327-1331 (2011).
- Pittenger, M. F., Martin, B. J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circulation Research. 95 (1), 9-20 (2004).
- Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
- Hocum Stone, L. L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Stone, L. L. H., et al. Mitochondrial Respiratory Capacity is Restored in Hibernating Cardiomyocytes Following Co-Culture with Mesenchymal Stem Cells. Cell Medicine. 11, 2155179019834938 (2019).
- Lamy, A., et al. Skeletonized vs Pedicled Internal Mammary Artery Graft Harvesting in Coronary Artery Bypass Surgery: A Post Hoc Analysis From the COMPASS Trial. JAMA Cardiology. 6 (9), 1042-1049 (2021).
- Shim, J. K., Choi, Y. S., Yoo, K. J., Kwak, Y. L. Carbon dioxide embolism induced right coronary artery ischaemia during off-pump obtuse marginalis artery grafting. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36 (3), 598-599 (2009).
- Aklog, L. Future technology for off-pump coronary artery bypass (OPCAB). Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 15 (1), 92-102 (2003).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112 (9 Suppl), I150-I156 (2005).
- Gallet, R., et al. Exosomes secreted by cardiosphere-derived cells reduce scarring, attenuate adverse remodelling, and improve function in acute and chronic porcine myocardial infarction. European Heart Journal. 38 (3), 201-211 (2017).
