Summary
Denne protokollen skisserer prosedyren for å skaffe og dyrke primære retinale pigmentepitelceller (RPE) fra lokalt hentede svineøyne. Disse cellene fungerer som et høyverdig alternativ til stamceller og er egnet for in vitro retinal forskning.
Abstract
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et avgjørende monolag i den ytre netthinnen som er ansvarlig for å støtte fotoreceptorer. RPE-degenerasjon forekommer ofte i sykdommer som er preget av progressivt synstap, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Forskning på AMD er ofte avhengig av menneskelige donorøyne eller induserte pluripotente stamceller (iPSCs) for å representere RPE. Disse RPE-kildene krever imidlertid utvidede differensieringsperioder og betydelig kompetanse for dyrking. I tillegg mangler noen forskningsinstitusjoner, spesielt de i landlige områder, lett tilgang til donorøyne. Mens en kommersielt tilgjengelig udødeliggjort RPE-cellelinje (ARPE-19) eksisterer, mangler den essensielle in vivo RPE-funksjoner og er ikke allment akseptert i mange oftalmologiforskningspublikasjoner. Det er et presserende behov for å skaffe representative primære RPE-celler fra en lettere tilgjengelig og kostnadseffektiv kilde. Denne protokollen belyser isolering og subkultur av primære RPE-celler oppnådd post mortem fra svineøyne, som kan hentes lokalt fra kommersielle eller akademiske leverandører. Denne protokollen nødvendiggjør vanlige materialer som vanligvis finnes i vevskulturlaboratorier. Resultatet er et primært, differensiert og kostnadseffektivt alternativ til iPSCs, menneskelige donorøyne og ARPE-19-celler.
Introduction
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et monolag som ligger i den ytre netthinnen mellom Bruchs membran og fotoreseptorene1. RPE-celler danner tette kryss med proteiner som zonula occludens-1 (ZO-1) og har en særegen fenotype karakterisert ved pigmentering og sekskantet morfologi 2,3. Disse cellene bidrar til blod-retinalbarrieren, og støtter dermed fotoreceptorhelsen og opprettholder retinal homeostase 4,5. I tillegg spiller RPE-celler en kritisk rolle i synet ved å absorbere lys og resirkulere viktige komponenter for fotoreceptorene6. For eksempel konverterer RPE65, et protein høyt uttrykt i RPE-celler, all-trans retinylestere til 11-cis retinol 7,8. Gitt de mange funksjonene som utføres av RPE-celler, er deres dysfunksjon involvert i ulike sykdommer, inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon og diabetisk retinopati 9,10. For å øke forståelsen av retinale patologier og utvikle nye behandlinger, brukes in vitro-modeller av netthinnen ofte.
For å generere representative modeller av sunne eller syke retinaer, er det viktig å bruke en mimetisk RPE-celletype. Den kommersielt tilgjengelige ARPE-19-cellelinjen mangler innfødte fenotyper, for eksempel pigmentering, mens iPSCs kan ta måneder å skille 11,12,13. Selv om menneskelige donorøyne kan være ideelle, er de ofte ikke lett tilgjengelige for mange forskningslaboratorier.
Her har vi utviklet en metode for å utnytte svineøyne, som deler mange likheter med menneskelige øyne14, for å oppnå primære RPE-celler. Disse primære svine-RPE-cellene har blitt brukt i flere retinale modeller15,16. Ikke bare er disse cellene kostnadseffektive, men de krever også mindre tid å skaffe seg enn iPSCs eller donorøyne. I tillegg viser de innfødte egenskaper, som pigmentering og mikrovilli. Mens lignende protokoller for RPE-ekstraksjon av svin eksisterer 17,18,19, validerer denne enkle og detaljerte teknikken ytterligere enzymatisk dissosiasjon og bruker materialer som ofte finnes i de fleste cellekulturlaboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Øynene som brukes i denne prosedyren er hentet post mortem fra en lokal, USDA-inspisert slakterbutikk, og det utføres ikke noe arbeid med levende dyr. Etter at dyrene har blitt ofret, går det ca. 2 timer før øynene er enukleert. Siden vevsforfall kan begynne å oppstå, er det viktig å holde øynene kjølige under transport for å forhindre ytterligere forfall. I denne prosedyren plasseres øynene umiddelbart i kjøleskap etter enukleasjon. Deretter plasseres posen med øyne inne i et 1000 ml polypropylenbeger og omgitt av is i en 8 L kjøler. Det er viktig å ikke plassere øynene direkte på isen. Når øynene kommer til laboratoriet, blir isoleringen av RPE-celler utført i et biosikkerhetsskap. Det er avgjørende å fullføre denne prosessen innen 3-5 timer. Denne protokollen er optimalisert for behandling av 10 øyne.
1. Forbereder DNase-aksjealikoter
MERK: Det anbefales at dette trinnet utføres før isolasjonen.
- Forbered en 5 mM kalsiumkloridoppløsning med sterilt avionisert vann.
FORSIKTIG: Kalsiumkloridpulver kan forårsake alvorlig øyeirritasjon eller skade. Bruk passende PPE. - Tilsett 5 mM kalsiumkloridoppløsning til DNase-pulver (se materialfortegnelse) for å få en endelig DNase-konsentrasjon på 3 mg/ml. Forsikre deg om at oppløsningen blandes grundig.
FORSIKTIG: DNase er en respiratorisk sensibiliseringsfare. Ikke inhaler pulver/substans. - Aliquot små volumer, for eksempel 1 ml, inn i mikrosentrifugerør.
- Frys alikotene ved -20 °C til bruk.
2. Oppsett av disseksjonsområdet
- Overfør de sterile disseksjonsinstrumentene og cellekulturutstyret til biosikkerhetskabinettet: kirurgisk drapering, petriskåler, cellesiler, brønnplater, gasbind, pinsett, skalpellhåndtak, skalpellblad og irissaks (se materialfortegnelse).
- Bruk pinsett, legg ut kirurgisk drapering. Plasser en 6-brønns plate på toppen av operasjonsgardinen og fjern lokket.
- Legg en aliquot av steril Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) på is og inn i biosikkerhetsskapet.
- Fyll en brønn av en 6-brønns plate halvveis full (omtrent 6 ml) av 10% povidon-jodoppløsning.
- Fyll de resterende brønnene med kjølt DPBS.
- Fjern lokket fra en av petriskålene og legg det, omvendt, på toppen av operasjonsgardinen. Sett petriskålbunnen til side som avfallsbeholder.
- Plasser en aliquot av cellekulturmedier (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% antibiotika / antimykotika) og en aliquot av 0,25% trypsin / EDTA i et 37 ° C vannbad.
- Fjern DNase-lagerløsningen fra fryseren (se resten av protokollen for mer informasjon).
3. Fjerning av utvendig vev
MERK: Fjerning av utvendig vev kan utføres utenfor biosikkerhetsskapet. Inspiser øyet før kutting for å sikre at sclera ikke er punktert, eleven er ikke tåkete, og optisk nerve er tilstede. Kast øyne som ikke oppfyller disse kriteriene.
- Mens du holder muskelen festet til øyet med den ene hånden, bruk den andre hånden til å forsiktig kutte bort vevet rundt sclera med en skalpell. Vær forsiktig så du ikke knuser øyet eller ved et uhell kutter gjennom sclera. Hvis sclera er skåret gjennom og eksponerer det svarte interiøret, kast øyet.
FORSIKTIG: En kuttbestandig hanske anbefales på det sterkeste for hånden som holder muskelen for å beskytte mot utilsiktede kutt. - Trim optisk nerve med buet iris saks til en lengde på ikke større enn 3 mm. Hvis optisk nerve er for lang, vil øyekoppen ikke sitte ordentlig i cellesilen senere.
- Legg øyet på is med hornhinnen ned.
- Gjenta trinn 3.1-3.3 til det ytre vevet er fjernet fra hvert øye.
4. Øyedisseksjon
- Bruk pinsett til å overføre et øye inn i biosikkerhetsskapet og inn i brønnen som inneholder 10% povidon-jodoppløsning og roter øyet for å sikre at det er fullt belagt i jodoppløsningen. For å holde verktøyene så sterile som mulig, bør disse pinsettene bare brukes til å berøre øyets utside.
- Mens øyet sitter i jodoppløsning, legg en steril gasbind på det grunne, omvendte lokket på petriskålen som ble tilberedt tidligere. I en separat petriskål, plasser en cellesil. Bruk bare cellesilen til å støtte øyekoppen, ikke for celleseparasjon.
- Etter å ha latt øyet sitte i jodoppløsning i omtrent 30 s, vask øyet ved å dyppe det i brønnene som inneholder DPBS i omtrent 5 s hver, flytte fra brønn til brønn for gradvis å fortynne jodoppløsningen, og overfør øyet til det sterile gasbindet.
- Lag et lite snitt ved hjelp av en skalpell under ora serrata, eller omtrent 1/3 nedover jordkloden fra iriskanten.
- Etter snittet, bruk irissaks til å kutte jevnt langs omkretsen av kloden, parallelt med hornhinnen. Når du manøvrerer øyet, bruk bare pinsetten til å berøre utsiden av øyet eller gasbindet for å opprettholde steriliteten.
- Bruk pinsetten til å ta tak i optisk nerve og løft forsiktig kloden bort fra gasbindet. Glasslegemet skal falle ut av kloden. Hvis nødvendig, rist forsiktig øyet for å hjelpe til med å løsne glasslegemet.
MERK: Hvis glasslegemet er svært vanskelig å fjerne, kan du prøve å kutte lavere på kloden. - Plasser øyekoppen forsiktig i den forberedte cellesilen, med det indre av øyekoppen vendt oppover. Hvis ujevn, bruk pinsett for å justere øyekoppen for å få snittet så nivå som mulig.
- Legg forsiktig avkjølt DPBS til øyekoppen slik at væskenivået er like under det laveste punktet på snittet. Denne DPBS vil bli fjernet etter fjerning av nevrale netthinnen.
MERK: Volumet av DPBS lagt vil variere avhengig av øyestørrelse og snittplassering. - Gjenta trinn 4.1-4.8 til alle øynene er dissekert.
5. Neural retina fjerning og RPE dissosiasjon
MERK: Følgende avsnitt er enklere å utføre trinnvis. I dette oppsettet utføres denne prosessen på en batch (vanligvis 3 øyekopper) om gangen. For trinn 5.1-5.7 bør hvert trinn utføres på hele gruppen før du går videre til neste trinn.
- Under en lommelykt, finn noen områder hvor nevrale retina (hvit / rosa) begynner å løsne fra RPE (svart). Bruk deretter stump pinsett for å forsiktig ta tak i den løftede nevrale netthinnen og skrelle den bort.
MERK: Hvis det ikke er noen områder hvor nevrale netthinnen løsner, bruk pinsetten til å ta den forsiktig nær toppen av øyekoppen. Ved hjelp av denne metoden, hvis det gjøres skade på RPE / choroid, vil disse cellene ikke bli dissosiert under RPE-samling. - Samle forsiktig nevrale netthinnen nær optisk plate.
- Aspirer ut den nevrale netthinnen ved hjelp av en Pasteur-pipette festet til et vakuumaspirasjonssystem. Det anbefales å fjære aspirasjonen for å hjelpe til med fjerningsprosessen.
MERK: En pipettespiss kan plasseres på enden av en Pasteur-pipette for å redusere sugekraft. - Legg forsiktig til ekstra avkjølte DPBS for å erstatte det som ble aspirert.
- Fjern gjenværende nevrale netthinnen ved å aspirere en gang til. Denne gangen, fjern så mye DPBS som mulig mens du ikke forstyrrer den eksponerte RPE.
- Legg forsiktig trypsin til øyekoppen. Hold volumnivået under snittlinjen og eventuelle deler av skadet RPE for å redusere forurensning.
FORSIKTIG: Trypsin er et enzym som vil forårsake hud- og øyeirritasjon ved kontakt. Bruk passende PPE. - Etter at trypsin er lagt til hvert øye, må du sørge for at petriskållokket byttes ut. Deretter overføres petriskålen til en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 minutter.
- Gjenta trinn 5.1–5.7 for hver batch til alle øyekoppene er behandlet.
6. RPE samling
- Samle RPE-cellene fra hver gruppe øyne (2-3 øyne) og legg i et enkelt 15 ml sentrifugerør for å gjøre såingsprosessen enkel.
- Under en lommelykt, triturer forsiktig med en 1000 μL pipette for å løsne RPE-cellene. Hvis RPE-cellene ikke løsner, tilsett fersk trypsin og inkuber i ytterligere 10-15 minutter. Vær forsiktig så du ikke skraper netthinnen.
- Samle RPE-cellene i et 15 ml sentrifugerør.
- Vask øyekoppen med cellekulturmedier for å samle eventuelle gjenværende celler og nøytralisere trypsinet. Forsikre deg om at det er minst dobbelt så stort volum av media til trypsin i sentrifugerøret på 15 ml.
- Gjenta trinn 6.1 til RPE-celler er samlet opp fra alle øyekoppene.
- Sentrifuger cellesuspensjonene ved 250 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
7. Forbereder DNase-arbeidsløsning
- Beregn volumet av 3 mg/ml DNase-stamløsning (fremstilt i trinn 1) som trengs for å tilsette cellekulturmedier for en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml og endelig volum på 3 ml per cellerør (dvs. for tre sentrifugerør av celler er 9 ml 100 μg/ml DNase-oppløsning nødvendig).
- Kombiner passende volumer av DNase-lagerløsning og cellekulturmedier. Bruk av DNase i arbeidsløsningen bidrar til å forhindre celleklumping og gjør at celler kan frøes jevnt.
8. RPE celle såing
- Etter sentrifugering i trinn 6.3, fjern supernatanter fra hvert 15 ml sentrifugerør, forsiktig så du ikke forstyrrer cellepelleten.
- Resuspender hver cellepellet i 3 ml DNase arbeidsløsning.
- Plasser 15 ml sentrifugerørene som inneholder de resuspenderte cellene i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 15 minutter.
- Etter inkubering, sentrifuge cellesuspensjonene ved 150 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatantene, forsiktig så du ikke forstyrrer cellepelletsene.
- Resuspender hver cellepellet i 3 ml ferske cellekulturmedier.
- For hvert sentrifugerør som inneholder 2-3 øyne verdt av RPE-celler, frø en brønn av en 6-brønnsplate (passasje 0).
- Overfør forsiktig den frøede 6-brønnsplaten til en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
9. Primær svin RPE-cellekultur
- La de nylig frøede RPE-cellene feste seg i 48-72 timer før du flytter platen. Under den første medieendringen kan en vask med ferske cellekulturmedier utføres for å fjerne overflødig celleavfall.
- Bytt cellekulturmediet hver 48.
- Når celler når konfluens, overgang til et cellekulturmedium med en FBS-konsentrasjon på 2% og oppretthold til eksperimentering.
10. RPE celle validering
- Immuncytokjemisk (ICC) farging
- Fest celler i 4% formaldehyd i DPBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vask to ganger med DPBS.
- Permeabiliser celler (om nødvendig) ved å bruke 0,2% Triton-X 100 i DPBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vask to ganger med DPBS.
- Påfør blokkeringsoppløsning av 3% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) i DPBS i 1 time ved romtemperatur.
- Tilsett primære antistoff ved 1:100 fortynning (eller anbefalt produsentkonsentrasjon) (se materialfortegnelse) og la stå i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
- Vask tre ganger med DPBS i 5 min hver.
- Tilsett sekundært antistoff (om nødvendig) ved 2 μg / ml (eller anbefalt produsentkonsentrasjon) (se materialfortegnelse) og la stå i 1 time ved romtemperatur.
- Vask tre ganger med DPBS i 5 minutter hver hvis sekundært antistoff påføres.
- Tilsett kjernefysisk fargesonde ved produsentens konsentrasjon (se materialfortegnelse) og la stå i 25 minutter ved romtemperatur.
- Vask tre ganger med PBS i 5 min hver.
- Hvis du er på en cellekulturinnsats, monter på mikroskopskyv med en dekselslip ved hjelp av monteringsmedium som beskrevet av Rickabaugh og Weatherston et al.20. Ellers bildeceller i DPBS.
- Skanning elektronmikroskopi (SEM)
- Følg prosedyren skissert av Harris et al.21.
- Transepitelial elektrisk motstand (TEER)
- Følg produsentens protokoll for TEER-måling (se materialfortegnelse) med 1 ml dyrkningsmedium i basalkammeret15.
- Enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA)
- Utfør ELISA15 ved hjelp av et multiplex humant enzymbundet immunosorbentanalysesett i henhold til produsentens protokoll (se materialtabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne prosedyren ble primære RPE-celler vellykket isolert fra svineøyne. Figur 1A viser RPE-celler 3 dager etter isolering med karakteristisk pigmentering. Etter 1 ukes vekst var cellene helt konfluente og dannet et sunt monolag (figur 1B). Celler ble deretter overført til cellekulturinnlegg hvor de opprettholdt pigmentering og morfologi (figur 1C), noe som ytterligere støttet effekten av isolasjonsprosedyren. Kulturer som ikke viste disse egenskapene, men i stedet viste variantmorfologi og overdreven pigmentering (figur 1D), ble mistenkt for cellulær forurensning og ikke brukt i eksperimenter. RPE-celler isolert i dette manuskriptet uttrykker RPE65, et protein som i stor grad uttrykkes i RPE-celler (figur 2). Områdene der RPE65-ekspresjon vises lavere, skyldes sannsynligvis pigmentering som blokkerer fluorescensen, da disse områdene tilsvarer tyngre pigmenterte celler (figur 2A). Et annet karakteristisk protein uttrykt av de isolerte RPE-cellene var VEGF. Etter 10 dager ble VEGF uttrykt mer på basalsiden av RPE-monolaget med en konsentrasjon på 2612,5 ± 28,0 pg/ml sammenlignet med apikalsiden med en konsentrasjon på 2141,2 ± 53,5 pg/ml (figur 3). Primære RPE-celler fra svin har også mikrovilli og brosteinsmorfologi (figur 4). I tillegg, når de ble dyrket på cellekulturinnlegg, økte TEER-avlesninger fra 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 etter 7 dager til 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 etter 14 dager (figur 5), noe som indikerer konsistent, sunn tett kryssdannelse over tid22. For å undersøke koblingsdannelse videre ble RPE-celler analysert for ZO-1-ekspresjon, som var lokalisert til cellegrenser, noe som antydet sunn koblingsdannelse og monolagsintegritet (figur 6).
Figur 1: Primær RPE etter å ha blitt sådd på brønnplater og subkulturert. Friske RPE-celler 3 dager etter isolering (A), fullt konfluent monolag 7 dager etter isolering (B), RPE vellykket passasje på et kulturinnlegg (C), og områder med potensiell cellulær forurensning (piler) på en RPE-kultur (D). Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunocytokjemiske bilder som viser RPE65-uttrykk i RPE-celler fra gris. Brightfield (A), RPE65 (B), kjerner (C) og sammenslåtte (D) bilder av celler 15 dager etter såing. Merk at den kornete bakgrunnen i brightfield-bildet er den porøse kulturinnsatsmembranen. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: VEGF-uttrykk i apikale og basale sider av RPE-monolaget. VEGF-konsentrasjon ble bestemt av en ELISA utført etter 10 dager med cellevekst på dyrkningsinnlegg. Feilfelt representerer standardavvik med n = 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilde av primære svine-RPE-celler. Cellene ble dyrket i 30 dager før avbildning. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TEER-avlesninger utført på RPE-celler dyrket på cellekulturinnsatser. Motstandsverdier etter 7, 10 og 14 dager med vekst. Feilfelt representerer standardavvik med n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Immunocytokjemiske bilder som viser ZO-1-uttrykk i RPE-celler fra svin. Brightfield (A) ZO-1 (B), kjerner (C) og sammenslåtte (D) bilder av celler 6 dager etter såing på brønnplater med glassbunn. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan man isolerer RPE-celler fra svineøyne. Pigmentering og brosteinsmorfologi ses innen 7 dager etter isolasjon (figur 1B). Videre indikerer TEER-data tett kryssdannelse22 og et sunt monolag (figur 5). Disse resultatene viser at RPE-celler isolert med denne metoden ligner på human RPE og kan være fordelaktige i retinale cellekulturmodeller.
Øynene som brukes i dette manuskriptet er hentet post mortem fra en lokal slakterbutikk, men kan også fås fra andre kilder, for eksempel akademiske miljøer med samarbeidspartnere som bruker svineprodukter. Det er viktig å starte prosedyren så snart som mulig etter dyredød og å holde øynene kjølige før prosedyren. Under isolasjonen er det viktig å ikke forstyrre RPE før triturering etter trypsinisering. Denne omsorgen er mest kritisk når du skreller nevrale netthinnen, da mangel på forsiktighet kan føre til å ta tak i Bruchs membran1 med pinsetten og introdusere andre celletyper i løsningen.
Selv om denne prosedyren er optimalisert for våre forhold, kan noen endringer gjøres i metodikken. For eksempel, hvis spesifikke såtettheter er ønsket, kan celler telles etter DNase-inkubasjonen. I tillegg, hvis vakuumaspirasjon ikke virker, kan nevrale netthinnen fjernes ved forsiktig trimming med små, buede sakser. Ved såing for eksperimenter kan en høy såtetthet som 2,5 x 105 celler / cm2 brukes til å forhindre overflødig cellulær deling. Videre anbefales ikke gjentatt passering, da cellene kan begynne å miste sine opprinnelige fenotyper. Mens denne studien har brukt passasje 1-celler for eksperimenter, kan ytterligere passasjer potensielt brukes hvis RPE-fenotype og egenskaper opprettholdes. Til slutt kan en konsentrasjon på 1% FBS brukes til subkultur eller eksperimentering i stedet for 2%, hvis ønskelig.
Det er noen ulemper med denne metoden. For det første er det vanskelig å replikere eller oppnå dyrs alder, kjønn, rase og dødstidspunkt, som er vanlige problemer i primærcelleisolasjon. For det andre kan overtrypsinisering raskt resultere i unormale celler, noe som også har blitt notert av Fietz et al17. Men til syvende og sist tilbyr denne metoden en billig og effektiv måte å skaffe primære RPE-celler på. Disse cellene krever ikke lange differensieringstider som iPSCs. Disse svin RPE har også medfødte nøkkelstrukturer, som mikrovilli og pigmentering15,16, i motsetning til deres ikke-differensierte kolleger. Som sådan tilbyr disse cellene en mer representativ celletype for retinalstudier. Til slutt kan denne metoden være svært gunstig for mer landlige områder eller institusjoner som ikke har tilgang til menneskelige donorøyne for å produsere retinale modeller analoge med menneskelige modeller for å forstå syn og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Farhad Farjood for hjelp med svin RPE cellekultur og isolasjon og Thomas Harris for hjelp med SEM. Forfatterne anerkjenner støtten fra Microscopy Core Facility ved Utah State University for SEM-analysen. Anlegget opprettholder et skanningelektronmikroskop anskaffet gjennom et National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Finansiering for denne studien ble gitt av en National Institutes of Health gjennom Grant 1R15EY028732 (Vargis) og en BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Ytterligere finansiering ble gitt av et Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) fra Utah State University's Office of Research og et frøstipend (Vargis) fra Utah State Universitys Alzheimers sykdom og demensforskningssenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
