Summary
Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.
Abstract
Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada fotoreseptörleri desteklemekten sorumlu çok önemli bir tek tabakadır. RPE dejenerasyonu genellikle yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi ilerleyici görme kaybıyla kendini gösteren hastalıklarda görülür. AMD üzerine yapılan araştırmalar genellikle RPE'yi temsil etmek için insan donör gözlerine veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) dayanır. Bununla birlikte, bu RPE kaynakları, uzun farklılaşma süreleri ve kültürleme için önemli uzmanlık gerektirir. Ek olarak, bazı araştırma kurumları, özellikle kırsal alanlardakiler, donör gözlerine kolay erişimden yoksundur. Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş bir RPE hücre dizisi (ARPE-19) mevcut olsa da, temel in vivo RPE özelliklerinden yoksundur ve birçok oftalmoloji araştırma yayınında yaygın olarak kabul görmemektedir. Temsili primer RPE hücrelerini daha kolay bulunabilen ve uygun maliyetli bir kaynaktan elde etmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu protokol, domuz gözlerinden ölüm sonrası elde edilen ve yerel olarak ticari veya akademik tedarikçilerden temin edilebilen primer RPE hücrelerinin izolasyonunu ve alt kültürünü açıklar. Bu protokol, tipik olarak doku kültürü laboratuvarlarında bulunan ortak materyalleri gerektirir. Sonuç, iPSC'lere, insan donör gözlerine ve ARPE-19 hücrelerine birincil, farklılaştırılmış ve uygun maliyetli bir alternatiftir.
Introduction
Retina pigment epiteli (RPE), dış retinada Bruch zarı ile fotoreseptörlerarasında bulunan bir tek tabakadır 1. RPE hücreleri, zonula okcludens-1 (ZO-1) gibi proteinlerle sıkı bağlantılar oluşturur ve pigmentasyon ve altıgen morfoloji 2,3 ile karakterize edilen ayırt edici bir fenotipe sahiptir. Bu hücreler kan-retina bariyerine katkıda bulunur, böylece fotoreseptör sağlığını destekler ve retina homeostazını korur 4,5. Ek olarak, RPE hücreleri, ışığı emerek ve fotoreseptörler için gerekli bileşenleri geri dönüştürerek görmede kritik bir rol oynar6. Örneğin, RPE hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen bir protein olan RPE65, all-trans retinil esterleri 11-cis retinol 7,8'e dönüştürür. RPE hücreleri tarafından gerçekleştirilen çok sayıda işlev göz önüne alındığında, işlev bozuklukları yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynar 9,10. Retina patolojilerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için retinanın in vitro modelleri sıklıkla kullanılmaktadır.
Sağlıklı veya hastalıklı retinaların temsili modellerini oluşturmak için, mimetik bir RPE hücre tipi kullanmak zorunludur. Ticari olarak temin edilebilen ARPE-19 hücre hattı, pigmentasyon gibi doğal fenotiplerden yoksunken, iPSC'lerin 11,12,13'ü ayırt etmesi aylar alabilir. İnsan donör gözleri ideal olsa da, çoğu araştırma laboratuvarı için genellikle hazır değildir.
Burada, birincil RPE hücrelerini elde etmek için insan gözüyle14 birçok benzerliği paylaşan domuz gözlerini kullanmak için bir yöntem geliştirdik. Bu primer domuz RPE hücreleri, çoklu retinal modellerdekullanılmıştır 15,16. Bu hücreler sadece uygun maliyetli olmakla kalmaz, aynı zamanda iPSC'lerden veya donör gözlerinden daha az zaman gerektirirler. Ek olarak, pigmentasyon ve mikrovillus gibi doğal özellikler sergilerler. Domuz RPE ekstraksiyonu için benzer protokoller mevcut olsada 17,18,19, bu basit ve ayrıntılı teknik, enzimatik ayrışmayı daha da doğrular ve çoğu hücre kültürü laboratuvarında yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedürde kullanılan gözler, USDA tarafından denetlenen yerel bir kasap dükkanından ölüm sonrası elde edilir ve canlı hayvanlar kullanılarak herhangi bir çalışma yapılmaz. Hayvanlar kurban edildikten sonra, gözler enükleasyona kadar yaklaşık 2 saat geçer. Doku çürümesi oluşmaya başlayabileceğinden, daha fazla çürümeyi önlemek için taşıma sırasında gözleri serin tutmak önemlidir. Bu prosedürde, enükleasyondan sonra gözler hemen bir buzdolabına yerleştirilir. Daha sonra, göz torbası 1000 mL'lik bir polipropilen kabın içine yerleştirilir ve 8 L'lik bir soğutucu içinde buzla çevrilidir. Gözleri doğrudan buzun üzerine koymamak önemlidir. Gözler laboratuvara geldikten sonra, RPE hücrelerinin izolasyonu bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilir. Bu işlemin 3-5 saat içinde tamamlanması çok önemlidir. Bu protokol 10 gözü işlemek için optimize edilmiştir.
1. DNase stok alikotlarının hazırlanması
NOT: Bu adımın izolasyondan önce gerçekleştirilmesi önerilir.
- Steril deiyonize su ile 5 mM'lik bir kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın.
DİKKAT: Kalsiyum klorür tozu ciddi göz tahrişine veya hasara neden olabilir. Uygun KKD giyin. - 3 mg / mL'lik bir nihai DNaz konsantrasyonu elde etmek için DNaz tozuna 5 mM kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Çözeltinin iyice karıştırıldığından emin olun.
DİKKAT: DNaz bir solunum hassasiyeti tehlikesidir. Tozu/maddeyi solumayın. - Küçük hacimleri, örneğin 1 mL'yi mikrosantrifüj tüplerine ayırın.
- Kullanana kadar alikotları -20 °C'de dondurun.
2. Diseksiyon alanının ayarlanması
- Steril diseksiyon aletlerini ve hücre kültürü ekipmanını biyogüvenlik kabinine aktarın: cerrahi örtü, Petri kapları, hücre süzgeçleri, kuyu plakaları, gazlı bez, cımbız, neşter sapı, neşter bıçağı ve iris makası (bkz.
- Cımbız kullanarak cerrahi örtüyü yerleştirin. Cerrahi örtünün üzerine 6 oyuklu bir plaka yerleştirin ve kapağı çıkarın.
- Steril Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin'inden (DPBS) bir alikotu buzun üzerine ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
- 6 oyuklu bir plakanın bir kuyusunu yarıya kadar dolu (kabaca 6 mL)% 10 povidon-iyot çözeltisi doldurun.
- Kalan kuyuları soğutulmuş DPBS ile doldurun.
- Petri kaplarından birinin kapağını çıkarın ve cerrahi örtünün üzerine ters çevirerek yerleştirin. Petri kabı tabanını atık kabı olarak bir kenara koyun.
- 37 ° C'lik bir su banyosuna bir hücre kültürü ortamı (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1 antibiyotik / antimikotik) ve% 0.25 tripsin / EDTA alikotu yerleştirin.
- DNase stok çözeltisini dondurucudan çıkarın (daha fazla ayrıntı için protokolün geri kalanına bakın).
3. Dış doku çıkarılması
NOT: Dış doku kaldırma işlemi biyogüvenlik kabini dışında gerçekleştirilebilir. Skleranın delinmediğinden, göz bebeğinin buğulu olmadığından ve optik sinirin mevcut olduğundan emin olmak için kesmeden önce gözü inceleyin. Bu kriterlere uymayan gözleri atın.
- Bir elinizle göze bağlı kası tutarken, diğer elinizle sklerayı çevreleyen dokuyu bir neşterle nazikçe kesmek için kullanın. Gözü ezmemeye veya yanlışlıkla sklerayı kesmemeye dikkat edin. Sklera kesilirse ve siyah iç kısmı açığa çıkarırsa, gözü atın.
DİKKAT: Kazara kesilmelere karşı koruma sağlamak için kası tutan el için kesilmeye dayanıklı bir eldiven şiddetle tavsiye edilir. - Optik siniri kavisli iris makasıyla 3 mm'den büyük olmayan bir uzunluğa kesin. Optik sinir çok uzunsa, göz kabı daha sonra hücre süzgecine düzgün oturmayacaktır.
- Gözü kornea aşağı bakacak şekilde buzun üzerine yerleştirin.
- Her bir gözden dış doku çıkarılana kadar 3.1-3.3 adımlarını tekrarlayın.
4. Göz diseksiyonu
- Bir gözü biyogüvenlik kabinine ve %10 povidon-iyot çözeltisi içeren kuyuya aktarmak için cımbız kullanın ve iyot çözeltisiyle tamamen kaplandığından emin olmak için gözü döndürün. Aletleri mümkün olduğunca steril tutmak için bu cımbız sadece gözün dışına dokunmak için kullanılmalıdır.
- Göz iyot çözeltisinde otururken, daha önce hazırlanan Petri kabının sığ, ters çevrilmiş kapağına steril bir gazlı bez yerleştirin. Ayrı bir Petri kabına bir hücre süzgeci yerleştirin. Hücre süzgecini yalnızca göz kapağını desteklemek için kullanın, hücre ayrımı için değil.
- Gözün iyot çözeltisinde yaklaşık 30 saniye oturmasına izin verdikten sonra, gözü DPBS içeren kuyucuklara her biri yaklaşık 5 saniye daldırarak yıkayın, iyot çözeltisini aşamalı olarak seyreltmek için kuyudan kuyuya hareket edin ve gözü steril gazlı beze aktarın.
- Ora serrata'nın altında bir neşter kullanarak veya iris kenarından kürenin kabaca 1/3'ü kadar küçük bir kesi yapın.
- Kesi işleminin ardından, korneaya paralel olarak dünyanın çevresi boyunca eşit şekilde kesmek için iris makası kullanın. Gözü hareket ettirirken, steriliteyi korumak için sadece gözün dışına veya gazlı beze dokunmak için cımbız kullanın.
- Optik siniri tutmak için cımbız kullanın ve küreyi gazlı bezden yavaşça kaldırın. Vitreus dünyadan düşmelidir. Gerekirse, vitreusun yerinden çıkmasına yardımcı olmak için gözü hafifçe sallayın.
NOT: Vitreusun çıkarılması çok zorsa, küreyi daha alçaktan kesmeyi deneyin. - Göz kabını, göz kabının içi yukarı bakacak şekilde hazırlanan hücre süzgecine nazikçe yerleştirin. Düzensizse, kesiği mümkün olduğunca düz hale getirmek için göz kabını ayarlamak için cımbız kullanın.
- Soğutulmuş DPBS'yi göz kabına nazikçe ekleyin, böylece sıvı seviyesi insizyonun en alt noktasının hemen altında olur. Bu DPBS, nöral retinanın çıkarılmasının ardından çıkarılacaktır.
NOT: Eklenen DPBS hacmi, göz boyutuna ve insizyon konumuna bağlı olarak değişecektir. - Tüm gözler diseke edilene kadar 4.1-4.8 adımlarını tekrarlayın.
5. Nöral retinanın çıkarılması ve RPE ayrışması
NOT: Aşağıdaki bölümün aşamalar halinde gerçekleştirilmesi daha kolaydır. Bu kurulumda, bu işlem bir seferde bir parti (genellikle 3 göz kabı) üzerinde gerçekleştirilir. 5.1-5.7 arasındaki adımlar için, bir sonraki adıma geçmeden önce her adım tüm partide gerçekleştirilmelidir.
- Bir el feneri altında, nöral retinanın (beyaz/pembe) RPE'den (siyah) ayrılmaya başladığı alanları bulun. Ardından, kaldırılan nöral retinayı nazikçe tutmak ve soymak için künt cımbız kullanın.
NOT: Nöral retinanın ayrıldığı alan yoksa, göz kabının üst kısmına yakın bir yerden nazikçe tutmak için cımbız kullanın. Bu yöntemi kullanarak, RPE / koroide zarar verilirse, bu hücreler RPE toplanması sırasında ayrışmayacaktır. - Nöral retinayı optik diskin yakınında nazikçe toplayın.
- Vakum aspirasyon sistemine bağlı bir Pasteur pipeti kullanarak nöral retinayı aspire edin. Çıkarma işlemine yardımcı olması için aspirasyonun yumuşatılması önerilir.
NOT: Emmeyi azaltmak için Pasteur pipetinin ucuna bir pipet ucu yerleştirilebilir. - Aspire edileni değiştirmek için dikkatlice ek soğutulmuş DPBS ekleyin.
- Kalan nöral retinayı bir kez daha aspire ederek çıkarın. Bu sefer, açıkta kalan RPE'yi rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla DPBS'yi çıkarın.
- Göz kabına yavaşça tripsin ekleyin. Kontaminasyonu azaltmak için ses seviyesini insizyon hattının ve hasarlı RPE'nin herhangi bir bölümünün altında tutun.
DİKKAT: Tripsin, temas halinde cilt ve göz tahrişine neden olacak bir enzimdir. Uygun KKD giyin. - Her göze tripsin eklendikten sonra, Petri kabı kapağının değiştirildiğinden emin olun. Daha sonra, Petri kabını 30 dakika boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.
- Tüm göz kapakları işlenene kadar her parti için 5.1-5.7 adımlarını tekrarlayın.
6. RPE koleksiyonu
- Her bir göz grubundan (2-3 göz) RPE hücrelerini toplayın ve tohumlama işlemini kolaylaştırmak için tek bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Bir el feneri altında, RPE hücrelerini yerinden çıkarmak için 1000 μL'lik bir pipet kullanarak hafifçe ezin. RPE hücreleri ayrılmıyorsa, taze tripsin ekleyin ve 10-15 dakika daha inkübe edin. Retinayı kazımamaya dikkat edin.
- RPE hücrelerini 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
- Kalan hücreleri toplamak ve tripsini nötralize etmek için göz kapağını hücre kültürü ortamıyla yıkayın. 15 mL santrifüj tüpünde tripsin için en az iki kat daha fazla ortam olduğundan emin olun.
- Tüm göz kapaklarından RPE hücreleri toplanana kadar adım 6.1'i tekrarlayın.
- Hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.
7. DNase çalışma çözümünün hazırlanması
- 100 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon ve hücre tüpü başına 3 mL'lik son hacim için hücre kültürü ortamına eklemek için gereken 3 mg/mL DNaz stok çözeltisinin (1. adımda hazırlanır) hacmini hesaplayın (yani, üç santrifüj tüpü için hücreler, 9 mL 100 μg/mL DNaz çözeltisi gereklidir).
- Uygun hacimlerde DNaz stok çözeltisini ve hücre kültürü ortamını birleştirin. Çalışma solüsyonunda DNaz kullanılması, hücre topaklanmasını önlemeye yardımcı olur ve hücrelerin eşit şekilde tohumlanmasını sağlar.
8. RPE hücre tohumlama
- Adım 6.3'teki santrifüjlemeyi takiben, hücre peletini bozmamaya dikkat ederek her 15 mL'lik santrifüj tüpünden süpernatanları çıkarın.
- Her hücre peletini 3 mL DNaz çalışma solüsyonunda yeniden süspanse edin.
- Yeniden süspanse edilmiş hücreleri içeren 15 mL'lik santrifüj tüplerini 37 ° C'de ve 15 dakika boyunca% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
- İnkübasyonun ardından, hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletlerini bozmamaya dikkat ederek süpernatantları çıkarın.
- Her hücre peletini 3 mL taze hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
- 2-3 göz değerinde RPE hücresi içeren her santrifüj tüpü için, 6 oyuklu bir plakadan bir kuyu tohumlayın (pasaj 0).
- Dikkatlice, tohumlanmış 6 oyuklu plakayı 37 ° C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.
9. Birincil domuz RPE hücre kültürü
- Plakayı hareket ettirmeden önce yeni tohumlanmış RPE hücrelerinin 48-72 saat bağlanmasına izin verin. İlk ortam değişimi sırasında, fazla hücre kalıntılarının giderilmesine yardımcı olmak için taze hücre kültürü ortamı ile yıkama yapılabilir.
- Hücre kültürü ortamını her 48 saatte bir değiştirin.
- Hücreler birleştiğinde, FBS konsantrasyonu %2 olan bir hücre kültürü ortamına geçin ve deneye kadar devam edin.
10. RPE hücre doğrulaması
- İmmünositokimyasal (ICC) boyama
- Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS'de% 4 formaldehit içinde sabitleyin.
- DPBS ile iki kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS'de% 0.2 Triton-X 100 kullanarak hücreleri (gerekirse) geçirgenleştirin.
- DPBS ile iki kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS'de% 3 (a / h) sığır serum albümini (BSA) bloke edici solüsyon uygulayın.
- 1:100 seyreltmede (veya önerilen üretici konsantrasyonunda) birincil antikor ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de bekletin.
- DPBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- İkincil antikor (gerekirse) 2 μg/mL'de (veya önerilen üretici konsantrasyonunda) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
- İkincil antikor uygulanırsa, her biri 5 dakika boyunca DPBS ile üç kez yıkayın.
- Üreticinin konsantrasyonunda nükleer boyama probu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığında 25 dakika bekletin.
- PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Bir hücre kültürü ekindeyse, Rickabaugh ve Weatherston ve ark.20 tarafından belirtildiği gibi montaj ortamı kullanarak bir lamel ile mikroskop lamına monte edin. Aksi takdirde, DPBS'deki görüntü hücreleri.
- Taramalı elektron mikroskobu (SEM)
- Harris ve ark.21 tarafından özetlenen prosedürü izleyin.
- Trans Epitelyal Elektrik Direnci (TEER)
- Bazal odada 1 mL kültür ortamı ile TEER ölçümü için üreticinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosuna bakın)15.
- Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)
- ELISA15'i, üreticinin protokolünü izleyerek multipleks bir insan enzimine bağlı immünosorbent test kiti kullanarak gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu prosedür kullanılarak, primer RPE hücreleri domuz gözlerinden başarılı bir şekilde izole edildi. Şekil 1A , karakteristik pigmentasyon ile izolasyondan 3 gün sonra RPE hücrelerini göstermektedir. 1 haftalık büyümeden sonra, hücreler tamamen birleşti ve sağlıklı bir tek tabaka oluşturdu (Şekil 1B). Hücreler daha sonra pigmentasyonlarını ve morfolojilerini korudukları hücre kültürü eklerine aktarıldı (Şekil 1C), bu da izolasyon prosedürünün etkinliğini daha da destekledi. Bu özellikleri sergilemeyen ve bunun yerine varyant morfolojisi ve aşırı pigmentasyon gösteren kültürler (Şekil 1D) hücresel kontaminasyondan şüphelenildi ve deneylerde kullanılmadı. Bu yazıda izole edilen RPE hücreleri, RPE hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen bir protein olan RPE65'i eksprese eder (Şekil 2). RPE65 ekspresyonunun daha düşük göründüğü alanlar, bu alanlar daha yoğun pigmentli hücrelere karşılık geldiğinden, floresansı bloke eden pigmentasyondan kaynaklanmaktadır (Şekil 2A). İzole RPE hücreleri tarafından eksprese edilen bir diğer karakteristik protein VEGF idi. 10 gün sonra, VEGF, RPE tek tabakasının bazal tarafında 2612.5 ± 28.0 pg/mL konsantrasyonda, apikal tarafta 2141.2 ± 53.5 pg/mL konsantrasyonda daha fazla eksprese edildi (Şekil 3). Primer domuz RPE hücreleri ayrıca mikrovillus ve parke taşı morfolojisine sahiptir (Şekil 4). Ek olarak, hücre kültürü eklerinde büyütüldüğünde, TEER okumaları 7 günde 166.1'den 75.9 Ω∙cm2 '± 14 gün sonra 363.4 ± 9.0 Ω∙cm2'ye yükseldi (Şekil 5), bu da zaman içinde tutarlı, sağlıklı sıkı bağlantı oluşumunu gösterir22. Kavşak oluşumunu daha fazla araştırmak için, RPE hücreleri, hücre sınırlarına lokalize olan, sağlıklı kavşak oluşumu ve tek tabaka bütünlüğü anlamına gelen ZO-1 ekspresyonu için analiz edildi (Şekil 6).
Şekil 1: Kuyu plakalarına tohumlandıktan ve alt kültürlendikten sonra birincil RPE. Sağlıklı RPE hücreleri, izolasyondan 3 gün sonra (A), izolasyondan 7 gün sonra (B), RPE, bir kültür ekine (C) başarıyla geçti ve bir RPE kültüründe (D) potansiyel hücresel kontaminasyon alanları (oklar). Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Domuz RPE hücrelerinde RPE65 ekspresyonunu gösteren immünositokimyasal görüntüler. Tohumlamadan 15 gün sonra hücrelerin Brightfield (A), RPE65 (B), çekirdekleri (C) ve birleştirilmiş (D) görüntüleri. Parlak alan görüntüsündeki grenli arka planın gözenekli kültür ekleme zarı olduğuna dikkat edin. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RPE tek tabakasının apikal ve bazal taraflarında VEGF ekspresyonu. VEGF konsantrasyonu, kültür eklerinde 10 günlük hücre büyümesinden sonra gerçekleştirilen bir ELISA ile belirlendi. Hata çubukları, n = 2 ile standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Primer domuz RPE hücrelerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü. Hücreler görüntülemeden önce 30 gün boyunca büyütüldü. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hücre kültürü eklerinde kültürlenen RPE hücreleri üzerinde gerçekleştirilen TEER okumaları. 7, 10 ve 14 günlük büyümeden sonraki direnç değerleri. Hata çubukları, n = 3 ile standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Domuz RPE hücrelerinde ZO-1 ekspresyonunu gösteren immünositokimyasal görüntüler. Brightfield (A) ZO-1 (B), çekirdekler (C) ve birleştirilmiş (D) hücrelerin cam tabanlı kuyu plakalarında tohumlamadan 6 gün sonra görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, RPE hücrelerinin domuz gözlerinden nasıl izole edileceğini açıklar. İzolasyondan sonraki 7 gün içinde pigmentasyon ve parke taşı morfolojisi görülür (Şekil 1B). Ayrıca, TEER verileri sıkı bağlantı oluşumunu22 ve sağlıklı bir tek tabakayı göstermektedir (Şekil 5). Bu sonuçlar, bu yöntemle izole edilen RPE hücrelerinin insan RPE'sine benzer olduğunu ve retina hücre kültürü modellerinde faydalı olabileceğini göstermektedir.
Bu el yazmasında kullanılan gözler, yerel bir kasap dükkanından ölüm sonrası elde edilmiştir, ancak domuz ürünleri kullanan işbirlikçilerle akademik ortamlar gibi diğer kaynaklardan da elde edilebilir. Hayvan ölümünden sonra mümkün olan en kısa sürede işleme başlamak ve işlemden önce gözleri serin tutmak önemlidir. İzolasyon sırasında, tripsinizasyondan sonra tritüre olana kadar RPE'yi bozmamak önemlidir. Bu bakım, nöral retinayı soyarken en kritik öneme sahiptir, çünkü dikkatli olunmaması, Bruch zarının1 cımbızla tutulmasına ve diğer hücre tiplerinin çözeltiye sokulmasına neden olabilir.
Bu prosedür koşullarımız için optimize edilmiş olsa da, metodolojide bazı değişiklikler yapılabilir. Örneğin, spesifik tohumlama yoğunlukları isteniyorsa, DNaz inkübasyonundan sonra hücreler sayılabilir. Ek olarak, vakum aspirasyonu çalışmıyorsa, nöral retina küçük, kavisli makasla dikkatlice kesilerek çıkarılabilir. Deneyler için tohumlama yaparken, aşırı hücresel bölünmeyi önlemek için 2.5 x 105 hücre/cm2 gibi yüksek bir tohumlama yoğunluğu kullanılabilir. Ayrıca, hücreler doğal fenotiplerini kaybetmeye başlayabileceğinden, tekrarlanan geçiş önerilmez. Bu çalışmada deneyler için pasaj 1 hücreleri kullanılmış olsa da, RPE fenotipi ve özellikleri korunursa potansiyel olarak ek pasajlar kullanılabilir. Son olarak, istenirse %2 yerine alt kültür veya deney için %1'lik bir FBS konsantrasyonu kullanılabilir.
Bu yöntemin birkaç dezavantajı vardır. Birincisi, birincil hücre izolasyonunda yaygın sorunlar olan hayvan yaşı, cinsiyeti, cinsi ve ölüm zamanını çoğaltmak veya elde etmek zordur. İkincisi, aşırı tripsinizasyon, Fietz ve ark.17 tarafından da belirtildiği gibi hızlı bir şekilde anormal hücrelere neden olabilir. Bununla birlikte, sonuçta, bu yöntem, birincil RPE hücrelerini elde etmek için ucuz ve verimli bir yol sunar. Bu hücreler, iPSC'ler gibi uzun farklılaşma süreleri gerektirmez. Bu domuz RPE'leri, farklılaşmamış muadillerinden farklı olarak, mikrovillus ve pigmentasyon15,16 gibi doğuştan anahtar yapılara sahiptir. Bu nedenle, bu hücreler retina çalışmaları için daha temsili bir hücre tipi sunar. Son olarak, bu yöntem, görme ve hastalığı anlamak için insan modellerine benzer retina modelleri üretmek için insan donör gözlerine erişimi olmayan daha kırsal alanlar veya kurumlar için çok faydalı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
Yazarlar, domuz RPE hücre kültürü ve izolasyonu ile ilgili yardımları için Farhad Farjood'a ve SEM ile ilgili yardımları için Thomas Harris'e teşekkür eder. Yazarlar, SEM analizi için Utah Eyalet Üniversitesi'ndeki Mikroskopi Çekirdek Tesisi'nin desteğini kabul ediyor. Tesis, Ulusal Bilim Vakfı Büyük Araştırma Enstrümantasyon Hibesi (CMMI-1337932) aracılığıyla edinilen bir taramalı elektron mikroskobuna sahiptir. Bu çalışmanın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Hibe 1R15EY028732 (Vargis) ve BrightFocus Vakfı Hibe M2019109 (Vargis) aracılığıyla sağlanmıştır. Ek finansman, Utah Eyalet Üniversitesi Araştırma Ofisi'nden bir Lisans Araştırma ve Yaratıcı Fırsatlar Hibesi (Weatherston) ve Utah Eyalet Üniversitesi Alzheimer Hastalığı ve Demans Araştırma Merkezi'nden bir tohum hibesi (Vargis) tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
