Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההליך להשגה וטיפוח של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים (RPE) מעיניים חזיריות ממקור מקומי. תאים אלו מהווים חלופה איכותית לתאי גזע ומתאימים למחקר רשתית במבחנה .
Abstract
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבה חיונית ברשתית החיצונית האחראית לתמיכה בפוטורצפטורים. ניוון RPE מתרחש בדרך כלל במחלות המסומנות על ידי אובדן ראייה מתקדם, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). מחקר על AMD מסתמך לעתים קרובות על עיניים מתורם אנושי או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) כדי לייצג את RPE. עם זאת, מקורות RPE אלה דורשים תקופות בידול ממושכות ומומחיות משמעותית לטיפוח. בנוסף, לחלק ממוסדות המחקר, במיוחד אלה באזורים כפריים, אין גישה נוחה לעיני התורם. בעוד קו תאי RPE אימורטלי זמין מסחרית (ARPE-19) קיים, הוא חסר תכונות RPE חיוניות in vivo ואינו מקובל באופן נרחב בפרסומים מחקריים רבים בתחום רפואת העיניים. יש צורך דחוף להשיג תאי RPE ראשוניים מייצגים ממקור זמין וחסכוני יותר. פרוטוקול זה מבהיר את הבידוד ותת-התרבות של תאי RPE ראשוניים המתקבלים לאחר המוות מעיניים חזיריות, אשר ניתן להשיג באופן מקומי מספקים מסחריים או אקדמיים. פרוטוקול זה מחייב חומרים נפוצים הנמצאים בדרך כלל במעבדות לתרביות רקמה. התוצאה היא חלופה ראשונית, מובחנת וחסכונית לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), עיני תורם אנושי ותאי ARPE-19.
Introduction
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי הממוקם ברשתית החיצונית בין קרום ברוך לבין הפוטורצפטורים1. תאי RPE יוצרים צמתים הדוקים עם חלבונים כגון zonula occludens-1 (ZO-1) ובעלי פנוטיפ ייחודי המאופיין בפיגמנטציה ומורפולוגיה משושה 2,3. תאים אלה תורמים למחסום הדם-רשתית, ובכך תומכים בבריאות קולטני האור ושומרים על הומאוסטזיס רשתית 4,5. בנוסף, תאי RPE ממלאים תפקיד קריטי בראייה על ידי קליטת אור ומיחזור רכיבים חיוניים עבור קולטני האור6. לדוגמה, RPE65, חלבון המתבטא היטב בתאי RPE, ממיר אסטרי רטיניל all-trans לרטינול 11-cis 7,8. בהתחשב במגוון התפקודים המבוצעים על ידי תאי RPE, חוסר התפקוד שלהם מעורב במחלות שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל ורטינופתיה סוכרתית 9,10. כדי לשפר את ההבנה של פתולוגיות רשתית ולפתח טיפולים חדשים, מודלים במבחנה של הרשתית משמשים לעתים קרובות.
כדי ליצור מודלים מייצגים של רשתיות בריאות או חולות, הכרחי להשתמש בסוג תא RPE מימטי. קו תאי ARPE-19 הזמין מסחרית חסר פנוטיפים מקוריים, כגון פיגמנטציה, בעוד iPSCs יכול לקחת חודשים כדי להבדיל 11,12,13. למרות שעיניים מתורם אנושי עשויות להיות אידיאליות, לעתים קרובות הן אינן זמינות למעבדות מחקר רבות.
כאן, פיתחנו שיטה לשימוש בעיניים חזיריות, החולקות קווי דמיון רבים עם עיניים אנושיות14, להשגת תאי RPE ראשוניים. תאי RPE חזיריים ראשוניים אלה שימשו במספר מודלים של רשתית15,16. לא רק שתאים אלה חסכוניים, הם גם דורשים פחות זמן לרכוש מאשר iPSCs או עיניים תורמות. בנוסף, הם מציגים מאפיינים מקומיים, כגון פיגמנטציה ומיקרוווילי. בעוד פרוטוקולים דומים למיצוי RPE חזירי קיימים 17,18,19, טכניקה פשוטה ומפורטת זו מאמתת עוד יותר דיסוציאציה אנזימטית ומשתמשת בחומרים הנפוצים ברוב מעבדות תרביות התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
העיניים המשמשות בהליך זה מתקבלות לאחר המוות מאטליז מקומי, שנבדק על ידי משרד החקלאות האמריקאי, ולא מתבצעת עבודה באמצעות בעלי חיים חיים. לאחר הקרבת בעלי החיים, חולפות כשעתיים עד שהעיניים מתחנכות. כמו ריקבון רקמות עלול להתחיל להתרחש, חשוב לשמור על העיניים קריר במהלך ההובלה כדי למנוע ריקבון נוסף. בהליך זה, העיניים ממוקמות מיד לתוך מקרר לאחר enucleation. לאחר מכן, שקית העיניים ממוקמת בתוך פוליפרופילן 1000 מ"ל ומוקפת קרח בתוך צידנית 8 ליטר. חשוב לא להניח את העיניים ישירות על הקרח. ברגע שהעיניים מגיעות למעבדה, הבידוד של תאי RPE מתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. חשוב להשלים תהליך זה תוך 3-5 שעות. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לעיבוד 10 עיניים.
1. הכנת מניות DNase aliquots
הערה: מומלץ לבצע שלב זה לפני הבידוד.
- הכינו תמיסת סידן כלורי 5 מ"מ עם מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה.
אזהרה: אבקת סידן כלורי עלולה לגרום לגירוי או נזק חמור לעיניים. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. - הוסף תמיסת סידן כלורי של 5 מ"מ לאבקת DNase (ראה טבלת חומרים) לקבלת ריכוז DNase סופי של 3 מ"ג/מ"ל. ודא שהפתרון מעורבב היטב.
אזהרה: DNase מהווה סכנת רגישות נשימתית. אין לשאוף אבקה/חומר. - Aliquot כרכים קטנים, למשל 1 מ"ל, לתוך צינורות microcentrifuge.
- יש להקפיא את aliquots ב -20 °C עד לשימוש.
2. הגדרת אזור הדיסקציה
- העבירו את מכשירי הדיסקציה הסטריליים ואת ציוד תרבית התאים לארון הבטיחות הביולוגית: רפש כירורגי, צלחות פטרי, מסננות תאים, צלחות באר, גזה, פינצטה, ידית אזמל, להב אזמל ומספריים של הקשתית (ראו טבלת חומרים).
- בעזרת פינצטה, הניחו את השפשוף הכירורגי. הניחו צלחת אחת בת 6 בארות על גבי וילון הניתוח והסירו את המכסה.
- הניחו אליקוט של מלח חוצץ פוספט סטרילי של דולבקו (DPBS) על קרח ולתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
- ממלאים באר אחת של צלחת 6 בארות באמצע הדרך המלאה (בערך 6 מ"ל) של 10% תמיסת פובידון-יוד.
- מלא את הבארות הנותרות עם DPBS צונן.
- הסירו את המכסה מאחת מצלחות הפטרי והניחו אותו, הפוך, על גבי הרפש הכירורגי. הניחו בצד את בסיס צלחת הפטרי כמיכל פסולת.
- הכניסו לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C אליציטוט של תרבית תאים (Dulbecco's Modified Eagle Medium), סרום בקר עוברי 10% (FBS), 1% אנטיביוטיקה/אנטימיקוטיקה) ואליקוט של 0.25% טריפסין/EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
- הסר את תמיסת מלאי DNase מהמקפיא (ראה שאר הפרוטוקול לפרטים נוספים).
3. הסרת רקמות חיצוניות
הערה: הסרת רקמות חיצוניות יכולה להתבצע מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית. בדוק את העין לפני החיתוך כדי לוודא כי לובן העין לא נוקב, האישון אינו מעורפל, ואת עצב הראייה קיים. השליכו עיניים שאינן עומדות בקריטריונים אלה.
- בזמן שאתה מחזיק את השריר המחובר לעין ביד אחת, השתמש ביד השנייה כדי לחתוך בעדינות את הרקמה המקיפה את לובן העין עם אזמל. היזהר לא למחוץ את העין או לחתוך בטעות דרך sclera. אם חותכים את לובן העין וחושפים את החלק הפנימי השחור, השליכו את העין.
זהירות: כפפה עמידה בפני חתכים מומלצת מאוד ליד האוחזת בשריר כדי להגן מפני חתכים בשוגג. - חתוך את עצב הראייה עם מספריים קשתית מעוקלות לאורך של לא יותר מ 3 מ"מ. אם עצב הראייה ארוך מדי, העין לא תשב כראוי במסננת התא מאוחר יותר.
- הניחו את העין על קרח עם הקרנית כלפי מטה.
- חזור על שלבים 3.1-3.3 עד להסרת הרקמה החיצונית מכל עין.
4. דיסקציה של העין
- השתמשו בפינצטה כדי להעביר עין לארון הבטיחות הביולוגית ולבאר המכילה 10% תמיסת פובידון-יוד ולסובב את העין כדי לוודא שהיא מצופה במלואה בתמיסת היוד. כדי לשמור על הכלים סטריליים ככל האפשר, פינצטה זו צריכה לשמש רק לגעת בחלק החיצוני של העין.
- בזמן שהעין יושבת בתמיסת יוד, הניחו גזה סטרילית על המכסה הרדוד וההפוך של צלחת הפטרי שהוכנה קודם לכן. בצלחת פטרי נפרדת, הניחו מסננת תאים. השתמש רק במסננת התאים לתמיכה בכוס העין, לא להפרדת תאים.
- לאחר שאפשרתם לעין לשבת בתמיסת יוד במשך כ-30 שניות, שטפו את העין על ידי טבילתה בבארות המכילות DPBS במשך כ-5 שניות כל אחת, עברו מבאר לבאר כדי לדלל בהדרגה את תמיסת היוד, והעבירו את העין לגזה הסטרילית.
- בצע חתך קטן באמצעות אזמל מתחת לאורה סראטה, או בערך 1/3 במורד הגלובוס מקצה הקשתית.
- לאחר החתך, השתמש במספריים הקשתית כדי לחתוך באופן שווה לאורך היקף כדור הארץ, במקביל לקרנית. בעת תמרון העין, השתמש רק בפינצטה כדי לגעת בחלק החיצוני של העין או בגזה כדי לשמור על סטריליות.
- השתמש בפינצטה כדי לתפוס את עצב הראייה ולהרים בעדינות את הגלובוס הרחק מהגזה. הזגוגית צריכה ליפול מהעולם. במידת הצורך, נערו בעדינות את העין כדי לעזור לעקור את הזגוגית.
הערה: אם קשה מאוד להסיר את הזגוגית, נסה לחתוך נמוך יותר על פני הגלובוס. - הניחו בעדינות את העיניים לתוך מסננת התאים המוכנה, כאשר פנים העין פונה כלפי מעלה. אם החתך אינו אחיד, השתמש בפינצטה כדי לכוונן את העין כדי לקבל את החתך ישר ככל האפשר.
- הוסיפו בעדינות DPBS מקורר לכוס העין כך שרמת הנוזלים תהיה ממש מתחת לנקודה הנמוכה ביותר של החתך. DPBS זה יוסר לאחר הסרת הרשתית העצבית.
הערה: נפח ה-DPBS שנוסף ישתנה בהתאם לגודל העיניים ולמיקום החתך. - חזור על שלבים 4.1-4.8 עד שכל העיניים ינותחו.
5. הסרת רשתית עצבית ודיסוציאציה RPE
הערה: קל יותר לבצע את הסעיף הבא בשלבים. בהגדרה זו, תהליך זה מתבצע על אצווה אחת (בדרך כלל 3 כוסות עיניים) בכל פעם. עבור שלבים 5.1-5.7, יש לבצע כל שלב בכל האצווה לפני המעבר לשלב הבא.
- מתחת לפנס, מצא אזורים שבהם הרשתית העצבית (לבנה/ורודה) מתחילה להתנתק מה-RPE (שחור). לאחר מכן, השתמש בפינצטה קהה כדי לתפוס בעדינות את הרשתית העצבית המורמת ולקלף אותה.
הערה: אם אין אזורים שבהם הרשתית העצבית מתנתקת, השתמש בפינצטה כדי לתפוס אותה בעדינות ליד החלק העליון של העין. בשיטה זו, אם נגרם נזק ל-RPE/כורואיד, תאים אלה לא ינותקו במהלך איסוף RPE. - לאסוף בעדינות את הרשתית העצבית ליד דיסק אופטי.
- שאפו החוצה את הרשתית העצבית באמצעות פיפטת פסטר המחוברת למערכת שאיפת ואקום. מומלץ להעצים את השאיפה לסייע בתהליך ההסרה.
הערה: ניתן להניח קצה פיפטה בקצה פיפטת פסטר כדי להפחית את היניקה. - הוסף בזהירות DPBS מקורר נוסף כדי להחליף את מה ששאף.
- הסר את הרשתית העצבית שנותרה על ידי שאיפה פעם נוספת. הפעם, הסירו כמה שיותר DPBS מבלי להפריע ל-RPE החשוף.
- הוסיפו בעדינות טריפסין לכוס העין. שמור על עוצמת הקול מתחת לקו החתך ועל כל החלקים של RPE פגום כדי להפחית את הזיהום.
אזהרה: טריפסין הוא אנזים שיגרום לגירוי בעור ובעיניים במגע. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. - לאחר הוספת טריפסין לכל עין, יש לוודא כי מכסה צלחת הפטרי מוחלף. לאחר מכן, להעביר את צלחת פטרי אינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 30 דקות.
- חזור על שלבים 5.1-5.7 עבור כל אצווה עד שכל כוסות העיניים יעובדו.
6. אוסף RPE
- אספו את תאי RPE מכל אצווה של עיניים (2-3 עיניים) והניחו בצינור צנטריפוגה יחיד של 15 מ"ל כדי להפוך את תהליך הזריעה לפשוט.
- תחת פנס, triturate בעדינות באמצעות פיפטה 1000 μL כדי לעקור את תאי RPE. אם תאי RPE אינם מתנתקים, הוסיפו טריפסין טרי ודגרו במשך 10-15 דקות נוספות. היזהרו לא לגרד את הרשתית.
- לאסוף את תאי RPE בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- שטפו את העין בתרבית תאים כדי לאסוף את התאים שנותרו ולנטרל את הטריפסין. ודא שיש לפחות נפח כפול של מדיה לטריפסין בצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל.
- חזור על שלב 6.1 עד שתאי RPE נאספו מכל כוסות העין.
- צנטריפוגה את מתלי התא ב 250 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הכנת פתרון עבודה DNase
- חשב את הנפח של 3 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי DNase (שהוכנה בשלב 1) הדרוש כדי להוסיף למדיה של תרבית תאים עבור ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ונפח סופי של 3 מ"ל לכל צינור של תאים (כלומר, עבור שלוש צינורות צנטריפוגות של תאים, 9 מ"ל של 100 מיקרוגרם / מ"ל תמיסת DNase נדרשת).
- שלב את הנפחים המתאימים של תמיסת מלאי DNase ומדיה של תרביות תאים. שימוש ב- DNase בתמיסת העבודה מסייע במניעת גושי תאים ומאפשר לזרוע תאים באופן שווה.
8. זריעת תאי RPE
- לאחר הצנטריפוגה בשלב 6.3, יש להסיר סופרנאטנטים מכל צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, תוך זהירות שלא לשבש את כדורית התא.
- השהה מחדש כל כדור תא ב- 3 מ"ל של תמיסת עבודה DNase.
- הניחו את צינורות הצנטריפוגות בנפח 15 מ"ל המכילים את התאים המרחפים לתוך אינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 15 דקות.
- לאחר הדגירה, צנטריפוגה את מתלי התא ב 150 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatants, נזהר לא לשבש את כדורי התא.
- יש להשהות מחדש כל כדורית תא ב-3 מ"ל של תרבית תאים טרייה.
- עבור כל צינור צנטריפוגה המכיל 2-3 עיניים של תאי RPE, זרעו באר אחת של צלחת 6 בארות (מעבר 0).
- בזהירות, להעביר את צלחת 6 בארות זרע לתוך אינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2.
9. תרבית תאי RPE חזירית ראשונית
- אפשרו לתאי RPE שזה עתה נזרעו להתחבר במשך 48-72 שעות לפני הזזת הצלחת. במהלך שינוי המדיה הראשון, ניתן לבצע שטיפה עם תרבית תאים טרייה כדי לסייע בהסרת פסולת תאים עודפת.
- החלף את מדיה תרבית התא כל 48 שעות.
- כאשר התאים מגיעים למפגש, יש לעבור למדיה של תרבית תאים עם ריכוז FBS של 2% ולשמור עד לניסויים.
10. אימות תאי RPE
- צביעה אימונוציטוכימית (ICC)
- תקן תאים בפורמלדהיד 4% ב- DPBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף פעמיים עם DPBS.
- חדרו תאים (במידת הצורך) באמצעות 0.2% Triton-X 100 ב-DPBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף פעמיים עם DPBS.
- יש למרוח תמיסת חסימה של אלבומין בסרום בקר (BSA) של 3% (w/v) ב-DPBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- יש להוסיף נוגדן ראשוני בדילול 1:100 (או ריכוז יצרן מומלץ) (ראו טבלת חומרים) ולהשאיר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה ב-4°C.
- שטפו שלוש פעמים עם DPBS במשך 5 דקות כל אחת.
- יש להוסיף נוגדן משני (במידת הצורך) במינון של 2 מק"ג/מ"ל (או ריכוז מומלץ של היצרן) (ראו טבלת חומרים) ולהשאיר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם DPBS במשך 5 דקות כל אחד אם מוחל נוגדן משני.
- יש להוסיף את בדיקת הצביעה הגרעינית בריכוז היצרן (ראו טבלת חומרים) ולהשאיר למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטפו שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת.
- אם על תוספת תרבית תאים, הרכבה למיקרוסקופ להחליק עם כיסוי באמצעות אמצעי הרכבה כפי שתואר על ידי Rickabaugh ו Weatherston et al.20. אחרת, תאי תמונה ב- DPBS.
- מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
- בצע את ההליך המתואר על ידי האריס ואחרים 21.
- התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (TEER)
- עקוב אחר פרוטוקול היצרן למדידת TEER (ראה טבלת חומרים) עם 1 מ"ל של מדיום תרבית בתא הבסיס15.
- בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA)
- בצע את ELISA15 באמצעות ערכת בדיקה אימונוסורבנטית מקושרת אנזימים אנושיים מרובים בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הליך זה, תאי RPE ראשוניים בודדו בהצלחה מעיניים חזיריות. איור 1A מראה תאי RPE 3 ימים לאחר בידוד עם פיגמנטציה אופיינית. לאחר שבוע אחד של גדילה, התאים נפגשו באופן מלא ויצרו שכבה חד-שכבתית בריאה (איור 1B). התאים הועברו לאחר מכן לתוספות תרבית תאים, שם הם שמרו על הפיגמנטציה והמורפולוגיה שלהם (איור 1C), מה שתומך עוד יותר ביעילות של הליך הבידוד. תרביות שלא הפגינו את המאפיינים האלה ובמקום זאת הראו מורפולוגיה משתנה ופיגמנטציה עודפת (איור 1D) נחשדו בזיהום תאי ולא שימשו בניסויים. תאי RPE שבודדו בכתב היד הזה מבטאים RPE65, חלבון שמתבטא מאוד בתאי RPE (איור 2). האזורים שבהם ביטוי RPE65 נראה נמוך יותר נובעים ככל הנראה מפיגמנטציה שחוסמת את הפלואורסצנטיות, מאחר שהאזורים האלה מתאימים לתאים בעלי פיגמנטציה כבדה יותר (איור 2A). חלבון אופייני נוסף שהתבטא בתאי RPE המבודדים היה VEGF. לאחר 10 ימים, VEGF התבטא יותר בצד הבסיסי של החד-שכבה RPE עם ריכוז של 2612.5 ±-28.0 pg/mL בהשוואה לצד האפי עם ריכוז של 2141.2 ±-53.5 pg/mL (איור 3). לתאי RPE חזיריים ראשוניים יש גם מורפולוגיית מיקרו-וילי ואבן מרוצפת (איור 4). נוסף על כך, כאשר גדלו על תוספות תרבית תאים, קריאות TEER גדלו מ-166.1 ±-75.9 Ω∙cm2 לאחר 7 ימים ל-363.4 ±-9.0 Ω∙cm2 לאחר 14 יום (איור 5), מה שמצביע על היווצרות עקבית ובריאה של צומת הדוק לאורך זמן22. כדי להמשיך לחקור את היווצרות הצמתים, תאי RPE נותחו עבור ביטוי ZO-1, אשר היה מקומי לגבולות התא, מה שמרמז על היווצרות צומת בריאה ושלמות חד-שכבתית (איור 6).
איור 1: RPE ראשוני לאחר שנזרע על צלחות באר ותת-תרבית. תאי RPE בריאים 3 ימים לאחר בידוד (A), חד-שכבה מתמזגת לחלוטין 7 ימים לאחר בידוד (B), RPE עבר בהצלחה לתוספת תרבית (C), ואזורים של זיהום תאי פוטנציאלי (חצים) על תרבית RPE (D). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות אימונוציטוכימיות שמראות ביטוי RPE65 בתאי RPE חזיריים. Brightfield (A), RPE65 (B), גרעינים (C) ותמונות ממוזגות (D) של תאים 15 יום לאחר הזריעה. שימו לב, הרקע המגורען בתמונת השדה הבהיר הוא קרום הוספת התרבית הנקבובית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי VEGF בצלעות אפיקליות ובסיסיות של חד-שכבה RPE. ריכוז VEGF נקבע על ידי ELISA שבוצע לאחר 10 ימים של גדילת תאים על תוספות תרבית. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן עם n = 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של תאי RPE חזיריים ראשוניים. התאים גודלו במשך 30 יום לפני ההדמיה. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: קריאות TEER שבוצעו על תאי RPE בתרבית על תוספות תרבית תאים. ערכי התנגדות לאחר 7, 10 ו-14 ימי צמיחה. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן עם n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונות אימונוציטוכימיות המראות ביטוי ZO-1 בתאי RPE חזיריים. ברייטפילד (A) ZO-1 (B), גרעינים (C) ותמונות ממוזגות (D) של תאים 6 ימים לאחר הזריעה על לוחות באר תחתית זכוכית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד תאי RPE מעיניים חזיריות. פיגמנטציה ומורפולוגיה מרוצפת נראים בתוך 7 ימים של בידוד (איור 1B). יתר על כן, נתוני TEER מצביעים על היווצרות צומת הדוקה22 וחד-שכבה בריאה (איור 5). תוצאות אלה מראות כי תאי RPE שבודדו בשיטה זו דומים ל-RPE אנושי ויכולים להועיל במודלים של תרביות תאי רשתית.
העיניים המשמשות בכתב יד זה מתקבלות לאחר המוות מאטליז מקומי, אך ניתן להשיג אותן גם ממקורות אחרים, כגון מסגרות אקדמיות עם משתפי פעולה המשתמשים במוצרים חזיריים. חשוב להתחיל את ההליך בהקדם האפשרי לאחר מוות של בעלי חיים ולשמור על קרירות העיניים לפני ההליך. במהלך הבידוד, חיוני לא לשבש את RPE עד triturating לאחר טריפסיניזציה. טיפול זה הוא קריטי ביותר בעת קילוף הרשתית העצבית, שכן חוסר זהירות עלול להוביל לתפיסת קרום1 של ברוך עם הפינצטה והחדרת סוגי תאים אחרים לתמיסה.
בעוד הליך זה הותאם לתנאים שלנו, ניתן לבצע כמה שינויים במתודולוגיה. לדוגמה, אם רוצים צפיפות זריעה ספציפית, ניתן לספור תאים לאחר הדגירה של DNase. בנוסף, אם שאיפת הוואקום אינה פועלת, ניתן להסיר את הרשתית העצבית על ידי חיתוך זהיר עם מספריים קטנים ומעוקלים. בעת זריעה לניסויים, צפיפות זריעה גבוהה כגון 2.5 x 105 תאים / ס"מ2 יכולה לשמש למניעת חלוקה תאית עודפת. יתר על כן, מעבר חוזר אינו מומלץ מכיוון שהתאים יכולים להתחיל לאבד את הפנוטיפים הטבעיים שלהם. בעוד שמחקר זה השתמש בתאי מעבר 1 לניסויים, מעברים נוספים עשויים לשמש אם הפנוטיפ והמאפיינים של RPE נשמרים. לבסוף, ריכוז של 1% FBS יכול לשמש עבור תת תרבות או ניסויים במקום 2%, אם תרצה.
ישנם כמה חסרונות לשיטה זו. ראשית, קשה לשכפל או להשיג גיל, מין, גזע וזמן מוות של בעלי חיים, שהן בעיות נפוצות בבידוד תאים ראשוני. שנית, טריפסיניזציה מוגזמת עלולה לגרום במהירות לתאים חריגים, דבר שצוין גם על ידי Fietz et al17. עם זאת, בסופו של דבר, שיטה זו מציעה דרך זולה ויעילה להשיג תאי RPE ראשוניים. תאים אלה אינם דורשים זמני התמיינות ארוכים כמו iPSCs. RPE חזירי זה יש גם באופן מולד מבנים מרכזיים, כמו microvilli ופיגמנטציה15,16, בניגוד עמיתיהם שאינם מובחנים. ככאלה, תאים אלה מציעים סוג תא מייצג יותר למחקרי רשתית. לבסוף, שיטה זו יכולה להיות מועילה מאוד עבור אזורים כפריים יותר או מוסדות שאין להם גישה לעיני תורם אנושי לייצר מודלים רשתית מקבילים למודלים אנושיים להבנת ראייה ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לפרהאד פרג'וד על העזרה בתרבית תאי RPE חזיריים ובידודם, ולתומאס האריס על העזרה עם SEM. המחברים מודים על התמיכה של מתקן הליבה מיקרוסקופיה באוניברסיטת מדינת יוטה לניתוח SEM. המתקן מחזיק במיקרוסקופ אלקטרונים סורק שנרכש באמצעות מענק מכשור מחקר מרכזי של הקרן הלאומית למדע (CMMI-1337932). המימון למחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק 1R15EY028732 (Vargis) ומענק קרן BrightFocus M2019109 (Vargis). מימון נוסף ניתן על ידי מענק מחקר והזדמנויות יצירתיות לתואר ראשון (Weatherston) ממשרד המחקר של אוניברסיטת מדינת יוטה ומענק זרע (Vargis) מהמרכז לחקר מחלת האלצהיימר והדמנציה של אוניברסיטת יוטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
