Summary
Denne protokol beskriver den inverterede emulsionsmetode, der bruges til at indkapsle et cellefrit ekspressionssystem (CFE) i en gigantisk unilamellær vesikel (GUV) til undersøgelse af syntese og inkorporering af et modelmembranprotein i lipid-dobbeltlaget.
Abstract
Cellefri ekspression (CFE) systemer er kraftfulde værktøjer inden for syntetisk biologi, der tillader biomimik af cellulære funktioner som biosensing og energiregenerering i syntetiske celler. Rekonstruktion af en lang række cellulære processer kræver imidlertid vellykket rekonstituering af membranproteiner i membranen af syntetiske celler. Mens ekspressionen af opløselige proteiner normalt er vellykket i almindelige CFE-systemer, har rekonstitutionen af membranproteiner i lipid-dobbeltlag af syntetiske celler vist sig at være udfordrende. Her demonstreres en metode til rekonstituering af et modelmembranprotein, bakteriel glutamatreceptor (GluR0), i gigantiske unilamellære vesikler (GUV'er) som modelsyntetiske celler baseret på indkapsling og inkubation af CFE-reaktionen inde i syntetiske celler. Ved at bruge denne platform demonstreres effekten af at substituere det N-terminale signalpeptid af GluR0 med proteorhodopsin-signalpeptid på vellykket cotranslationel translokation af GluR0 til membraner af hybride GUV'er. Denne metode giver en robust procedure, der vil tillade cellefri rekonstitution af forskellige membranproteiner i syntetiske celler.
Introduction
Bottom-up syntetisk biologi har fået stigende interesse i løbet af det sidste årti som et nyt felt med adskillige potentielle anvendelser inden for bioengineering, lægemiddellevering og regenerativ medicin 1,2. Udviklingen af syntetiske celler som en hjørnesten i især bottom-up syntetisk biologi har tiltrukket en bred vifte af videnskabelige samfund på grund af de lovende anvendelser af syntetiske celler samt deres cellelignende fysiske og biokemiske egenskaber, der letter in vitro biofysiske undersøgelser 3,4,5,6 . Syntetiske celler er ofte konstrueret i cellestore gigantiske unilamellære vesikler (GUV'er), hvor forskellige biologiske processer genskabes. Rekonstitution af cellecytoskelet 7,8, lysafhængig energiregenerering9, cellulær kommunikation10,11 og biosensing12 er eksempler på bestræbelser på at rekonstruere cellelignende adfærd i syntetiske celler.
Mens nogle cellulære processer er afhængige af opløselige proteiner, bruger mange egenskaber ved naturlige celler, såsom sansning og kommunikation, ofte membranproteiner, herunder ionkanaler, receptorer og transportører. En stor udfordring i udviklingen af syntetiske celler er rekonstituering af membranproteiner. Selvom traditionelle metoder til membranproteinrekonstitution i lipid-dobbeltlag er afhængige af vaskemiddelmedieret oprensning, er sådanne metoder besværlige, ineffektive for proteiner, der er giftige for ekspressionsværten, eller ofte ikke er egnede til membranproteinrekonstitution i GUV'er13.
En alternativ metode til proteinekspression er cellefri ekspression (CFE) systemer. CFE-systemer har været et kraftfuldt værktøj inden for syntetisk biologi, der tillader in vitro-ekspression af forskellige proteiner ved hjælp af enten cellelysat eller oprenset transkriptions-translationsmaskineri14. CFE-systemer kan også indkapsles i GUV'er, hvilket muliggør kompartmenterede proteinsyntesereaktioner, der kan programmeres til forskellige applikationer, såsom skabelse af lyshøstende syntetiske celler9 eller mekanofølsomme biosensorer15,16. Analogt med rekombinante proteinekspressionsmetoder er membranproteinekspression udfordrende i CFE-systemer17. Aggregering, fejlfoldning og mangel på post-translationel modifikation i CFE-systemer er store flaskehalse, der hindrer vellykket membranproteinsyntese ved hjælp af CFE-systemer. Vanskeligheden ved bottom-up membranproteinrekonstituering ved hjælp af CFE-systemer skyldes til dels fraværet af en kompleks membranproteinbiogenesevej, der er afhængig af signalpeptider, signalgenkendelsespartikler, translokoner og chaperoning-molekyler. Men for nylig har flere undersøgelser antydet, at tilstedeværelsen af membranøse strukturer såsom mikrosomer eller liposomer under translation fremmer vellykket membranproteinekspression 18,19,20,21. Derudover har Eaglesfield et al. og Steinküher et al. fundet ud af, at inkluderingen af specifikke hydrofobe domæner kendt som signalpeptider i membranproteinets N-terminal kan forbedre dets ekspressionbetydeligt 22,23. Alt i alt tyder disse undersøgelser på, at udfordringen med membranproteinrekonstitution i syntetiske celler kan overvindes, hvis proteinoversættelsen sker i nærvær af GUV-membranen, og hvis korrekt N-terminalt signalpeptid anvendes.
Her præsenteres en protokol til indkapsling af proteinsyntesen ved hjælp af rekombinante elementer (PURE) CFE-reaktioner til membranproteinrekonstitution i GUV'er. Bakteriel glutamatreceptor24 (GluR0) vælges som modelmembranprotein, og effekten af dets N-terminale signalpeptid på dets membranrekonstitution undersøges. Effekten af proteorhodopsin-signalpeptid, som blev vist at forbedre membranproteinrekonstitueringseffektiviteten af Eaglesfield et al.22, undersøges ved at konstruere en muteret variant af GluR0 betegnet som PRSP-GluR0 og dens ekspression og membranlokalisering med vildtype GluR0 (herefter benævnt WT-GluR0), der rummer dets oprindelige signalpeptid, sammenlignes. Denne protokol er baseret på den inverterede emulsionsmetode25 med modifikationer, der gør den robust til CFE-indkapsling. I den præsenterede metode emulgeres CFE-reaktionerne først ved hjælp af en lipid-i-olie-opløsning, der genererer dråber på mikronstørrelse, der indeholder CFE-systemet og stabiliseres af lipidmonolaget. Emulsionsdråberne lægges derefter oven på en olie-vand-grænseflade, der er mættet med et andet lipid-monolag. Emulsionsdråberne tvinges derefter til at bevæge sig hen over olie-vand-grænsefladen via centrifugalkraft. Gennem denne proces opnår dråberne endnu et monolag, hvilket genererer en tolags lipidvesikel. GUV'erne, der indeholder CFE-reaktionen, inkuberes derefter, hvor membranproteinet udtrykkes og inkorporeres i GUV-membranen. Selvom denne protokol er specificeret til cellefri ekspression af GluR0, kan den bruges til cellefri syntese af andre membranproteiner eller forskellige syntetiske celleapplikationer såsom cytoskeletrekonstitution eller membranfusionsundersøgelser26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De reagenser og det udstyr, der anvendes til denne undersøgelse, er angivet i materialetabellen.
1. CFE-bulkreaktioner i nærvær af små unilamellære vesikler (SUV'er)
- Forberedelse af SUV
BEMÆRK VENLIGST: Dette trin skal udføres i et stinkskab i henhold til sikkerhedsinstruktionerne for arbejde med kloroform.- Forbered 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) SUV'er i et hætteglas ved at overføre 76 μL 25 mg/ml POPC-stamopløsning opløst i chloroform.
- Mens du forsigtigt roterer hætteglasset, blæs en blid strøm af argon ind i hætteglasset for at danne en film af tørrede lipider i bunden. Overfør derefter hætteglasset til en ekssikkator med hætten løst skruet for at fordampe overskydende chloroform.
- Opbevar hætteglasset i ekssikkatoren i 1 time. Tilsæt derefter 0,5 ml ultrarent deioniseret vand for at opløse lipidfilmen og hvirvelen i ca. 2 minutter.
- Opsæt et mini-ekstruderingsapparat ved at lægge to filterstøtter i blød i deioniseret vand og placere dem på hver af de indvendige membranstøtter. Læg derefter et 100 nm polycarbonatfilter i blød og placer det mellem de to indvendige membranstøtter, der holdes sammen af ekstruderens ydre hus og holdermøtrikken. Placer denne opsætning i ekstruderstativet.
- Skyl to 1 ml gastætte sprøjter 3 gange med ultrarent deioniseret vand.
- Læg sample af lipid-vandblanding i en af de 1 ml gastætte sprøjter, og placer den i den ene ende af miniekstruderen ved hjælp af svingarmsclipsene til at holde sprøjten på plads. Indsæt den anden sprøjte i den anden ende af mini-ekstruderen, og sørg for, at den er trykket helt ned.
BEMÆRK VENLIGST: Når du fylder sprøjten med lipid-vandblandingen, skal du sikre dig, at der ikke er luft i sprøjten, før du fører den gennem mini-ekstruderen. - Før forsigtigt lipid-vandblandingen fra den originale sprøjte til den tomme sprøjte gennem mini-ekstruderapparatet. Gentag dette trin 11 gange for at danne SUV'er. Overfør SUV'erne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: SUV-opløsningen kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- CFE-reaktionssamling
- Saml CFE-reaktionen ved at følge den cellefrie ekspressionsprotokol leveret af producenten med små ændringer beskrevet i det følgende.
- Bland 10 μL opløsning 1 (indeholdende aminosyrer, NTP'er, tRNA'er og substrater for enzymer og nødvendig buffer), 1 μL opløsning 2 (proteiner i 20% glycerol), 2 μL opløsning 3 (ribosom (20 μM)), passende mængde af DNA'et, der koder for opløseligt sfGFP-sfCherry(1-10)27 (i det følgende benævnt opløseligt sfGFP), WT-GluR0-sfGFP eller PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 basepar), 1 μL murin RNAse-hæmmer og 4 μL 5 mM SUV-opløsning til membranproteiner eller 4 μL vand til opløselige proteiner.
- Bring reaktionens endelige volumen til 20 μL ved at tilsætte ultrarent deioniseret vand.
BEMÆRK VENLIGST: Ved montering af CFE-systemet skal alle komponenter holdes på is. Alle materialer er temperaturfølsomme og kan nedbrydes, hvis de når stuetemperatur.
- CFE-reaktionsinkubation og overvågning
- Overfør CFE-opløsningen til en 96-brønds konisk V-bundplade. For at forhindre fordampning i løbet af reaktionen skal du dække pladen med en tætningsfilm.
- Inkuber pladen ved 37 °C i en pladelæser i 4-5 timer, mens du overvåger CFE-reaktionen ved at måle GFP-signalet med en forstærkning på 100 ved 488 nm/528 nm excitations-/emissionsbølgelængder hvert 2. minut.
2. CFE-reaktioner indkapslet i GUV'er
- Fremstilling af GUV ydre bufferopløsning
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør blandes 1,5 μL 1 M spermidin, 37,5 μL 100 mM ATP, 25 μL 100 mM GTP, 12,5 μL 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M kreatinphosphat, 18 μL 1 M magnesiumacetat, 93,33 μL 3 M kaliumglutamat 50 μL 1 M HEPES KOH (pH 7.4), 1.15 μL 332 mM folinsyre, 100 μL 2 M glukose og 50 μL fra stamopløsning af 6 mM blanding af hver af de 20 aminosyrer (fremstillet ved at følge protokollen beskrevet af Sun et al.28).
- Bring opløsningens endelige volumen til 1 ml ved at tilsætte ultrarenset deioniseret vand.
BEMÆRK VENLIGST: Alle komponenter skal opbevares på is. Tilsæt aminosyreblandingen til sidst for at undgå udtømning af aminosyrer28. Opløsningen kan alikvoteres i 330 μL afpipetteringer og opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Fremstilling af lipid-i-olie-blandingen
BEMÆRK: dette trin skal udføres i et stinkskab efter sikkerhedsinstruktionerne for arbejde med chloroform.- I et stinkskab blandes 17,3 μL 25 mg/ml POPC-stamopløsning og 1,08 μL 50 mg/ml poly(butadien)-b-poly(ethylenoxid) (PEO-b-PBD) copolymer i et 15 ml hætteglas af glas.
BEMÆRK VENLIGST: Den endelige lipid-i-olie-opløsning indeholder 0,5 mM lipid med henholdsvis 95% og 5% POPC og PEO-b-PBD. PEO-b-PBD blev brugt til at forbedre membranstabiliteten under proteinekspression, men blev holdt i et lavt molærforhold for at reducere copolymerens tendens til at aggregere i miceller adskilt fra lipidmolekyler29,30. - Blæs forsigtigt en blid strøm af argongas ind i hætteglasset, mens du drejer hætteglasset for at fordampe kloroformen.
- Pipetter 1,2 ml let mineralolie i 15 ml hætteglasset med de tørrede lipider.
- Bland lipider og olie ved at hvirvle ved maksimal hastighed i 10-20 s. Den opløste lipid-copolymerblanding vil se uklar ud.
- For at sikre, at alle mulige lipidaggregater i olien er fuldt opløst og spredt i hele olien, skal du placere hætteglasset i en ovn ved ca. 50 °C i 20 minutter, før det hvirvler i yderligere 10-20 sekunder ved maksimal hastighed.
- I et stinkskab blandes 17,3 μL 25 mg/ml POPC-stamopløsning og 1,08 μL 50 mg/ml poly(butadien)-b-poly(ethylenoxid) (PEO-b-PBD) copolymer i et 15 ml hætteglas af glas.
- CFE-reaktionssamling og -indkapsling (figur 1 opsummerer følgende trin).
- Forbered 300 μL af den ydre GUV-opløsning i et 1.5 ml mikrocentrifugerør ved at blande 270 μL CFE ydre bufferopløsning fremstillet i trin 2.1, 15 μL 5 M NaCl og 15 μL 4.5 M KCl.
BEMÆRK VENLIGST: På dette trin tilsættes 0.45 μL 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) til den ydre GUV-opløsning. Formålet med at tilføje NaCl og KCl er at justere den ydre opløsnings osmolalitet, så den matcher den med den indre CFE-opløsning. Det nøjagtige volumen af NaCl og KCl afhænger af den ønskede osmolalitetsjustering. Man kan tilføje enten NaCl eller KCl eller begge dele for at justere osmolaliteten. - Pipetter forsigtigt 300 μL lipid-i-olie-blanding oven på den ydre GUV-opløsning.
BEMÆRK VENLIGST: Når du tilsætter lipid-olieblandingen, er det vigtigt, at olien ikke blandes med den vandige ydre opløsning. Efter tilsætningen skal der være en synlig grænseflade mellem lipid-i-olie-blandingen og den ydre GUV-opløsning. - Inkuber olie-vand-grænsefladen ved stuetemperatur i 2 timer for at lade lipidmonolaget dannes og stabilisere sig ved grænsefladen.
- I mellemtiden skal du følge afsnit 1.2.1 for at samle en CFE-reaktion, der indeholder plasmid-DNA'et, der koder for membranproteinvarianterne eller opløselig GFP. Udskift 4 μL 5 mM SUV-opløsning eller vand med 4 μL 1 M saccharose. Denne reaktion vil være den indre GUV-løsning.
BEMÆRK: Et osmometer blev brugt til at måle osmolaliteten af de indre og ydre opløsninger. Osmolaliteten af den ydre opløsning blev derefter justeret i overensstemmelse hermed ved tilsætning af NaCl eller vand. Osmolaliteten af CFE-reaktionen er typisk omkring 1600 mOsm/Kg. Tilsætning af saccharose til reaktionen øger den indre opløsningstæthed, hvilket gør det muligt for vesiklerne at bevæge sig over olie-vand-grænsefladen under centrifugeringstrinnet. Et alternativ til saccharose er Opti-Prep densitetsgradientløsningen. - Tilsæt 600 μL lipid-olieblanding til mikrocentrifugerøret, der indeholder CFE-reaktionen, og pipetter kraftigt op og ned i ~ 1 minut for at emulgere reaktionen i lipid-i-olie-opløsning og danne lipidmonolaget omkring syntetiske celler.
BEMÆRK VENLIGST: Den endelige opløsning bør ikke have nogen bobler og skal se uigennemsigtig ud. - Pipetterer forsigtigt den indvendige opløsningsemulsion oven på olielaget i 1,5 ml mikrocentrifugerøret, hvor olie-vand-grænsefladen blev sat op.
BEMÆRK VENLIGST: Pas på ikke at forstyrre eller destabilisere grænsefladen. - Centrifuger i 10 minutter ved 2.000 x g ved 4 °C.
BEMÆRK VENLIGST: Centrifugeringshastigheden blev optimeret til denne protokol. Adir et al.31 rapporterede en anden centrifugeringshastighed. - Når centrifugeringen er overstået, skal du forsigtigt fjerne den overskydende olie og den ydre opløsning fra mikrocentrifugerøret ved hjælp af en pipettor. Fjern den ydre opløsning, indtil det resterende volumen er omkring 100 μL.
BEMÆRK VENLIGST: En pellet af GUV'er er normalt synlig i bunden af mikrocentrifugerøret. Mangel på en synlig pellet betyder dog ikke nødvendigvis intet GUV-udbytte. I stedet for at bruge en pipettor kan den overskydende olie oven på den ydre opløsning fjernes ved aspiration. Det er afgørende at sikre, at lipid-i-olie-opløsningen fjernes fuldstændigt. Olieforurening i GUV-opløsning kan forårsage billeder af lav kvalitet. - Gensuspender GUV-pelleten i den resterende 100 μL opløsning ved forsigtigt at pipettere op og ned. Overfør derefter GUV-opløsningen til en ren 96 godt klar flad bundplade for at inkubere.
- Forbered 300 μL af den ydre GUV-opløsning i et 1.5 ml mikrocentrifugerør ved at blande 270 μL CFE ydre bufferopløsning fremstillet i trin 2.1, 15 μL 5 M NaCl og 15 μL 4.5 M KCl.
3. Indkapslet CFE-reaktionsinkubation og billeddannelse
- Dæk pladen med en tætningsfilm for at forhindre fordampning. Inkuber pladen ved 37 °C i 5-6 timer. Man kan bruge en pladelæser og følge trin 1.3.2 for at forberede pladelæseren til inkubationstrinnet.
- Når inkubationen er overstået, placeres 96-brøndspladen på billeddannelsestrinnet i et omvendt mikroskop udstyret med et EMCCD-kamera (eller et sCMOS-kamera), DAQ-MX-kontrolleret laser (eller et integreret laserkombinatorsystem) og en CSU-X1 roterende disk konfokal (eller en laserscanningskonfokal). Fokuser på enhver ROI, der indeholder GUV'er, og tag billeder ved en excitationsbølgelængde på 488 nm ved hjælp af et Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA-objektiv.
- Gem billeder af GUV'er i .tiff format.
- Åbn billederne i et billedbehandlingsprogram (f.eks. ImageJ eller Fiji). Åbn indstillingspanelet Lysstyrke/kontrast . Juster lysstyrken og kontrasten til passende indstillinger, der gør fluorescerende proteiner synlige.
- Hvis målet er at sammenligne signalintensiteten af forskellige udtrykte proteiner, skal du først stable individuelle billeder af GUV'er, der indeholder forskellige proteiner ved hjælp af panelet Billeder, der skal stables under undermenuen Billede > stakke . Juster derefter lysstyrken og kontrasten for alle billeder ved hjælp af panelet Lysstyrke/kontrast .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før indkapslingen af CFE-reaktionerne blev to varianter af GluR0-sfGFP med native og proteorhodopsin-signalpeptider (signalpeptidsekvenser er præsenteret i supplerende tabel 1), og den opløselige sfGFP blev individuelt udtrykt i bulkreaktioner, og deres ekspression blev overvåget ved at detektere sfGFP-signalet ved hjælp af en pladelæser (figur 2A). Membranproteiner blev udtrykt i fravær eller tilstedeværelse af 100 nm SUV'er. Derudover blev koncentrationer af syntetiserede proteiner estimeret ved hjælp af en kalibreringskurve, der korrelerer sfGFP-signalet med dets koncentration (supplerende figur 1) (supplerende tabel 2). Det er klart, at opløselig sfGFP havde det højeste udtryk blandt alle tre proteiner, hvilket tyder på, at ekspressionen af membranproteiner pålægger CFE-systemet en byrde og dermed bremser reaktionen og sænker dens udbytte. Derudover viste reaktioner, der udtrykker membranproteiner i nærvær af SUV'er, i gennemsnit højere sfGFP-signal sammenlignet med reaktioner, der mangler SUV'er. Denne observation stemmer overens med resultaterne fra Steinküher et al., som viste, at ekspressionen af membranproteiner reducerer CFE-systemernes kapacitet til at producere proteiner23. Ikke desto mindre, i betragtning af den vellykkede demonstration af proteinekspression i bulk CFE-reaktion, kan man ræsonnere, at indkapslet CFE også vil syntetisere proteiner inde i GUV'er.
Dernæst blev individuelle CFE-reaktioner indkapslet i GUV'er ved hjælp af den inverterede emulsionsmetode til at udtrykke varianter af GluR0, nemlig WT-GluR0, PRSP-GluR0 og opløselig sfGFP. Mens WT-GluR0, der rummer GluR0 native signalpeptid, viste fremragende ekspression og membranlokalisering (figur 2B, venstre panel), viste dets modstykke, PRSP-GluR0, som har proteorhodopsin N-terminalt signalpeptid, ikke lignende stærk membranlokalisering. PRSP-GluR0 viste sig at være mere tilbøjelig til aggregering og punktdannelse (figur 2B, midterste panel). Som forventet blev opløseligt sfGFP udtrykt i GUV'er og forblev i GUV-lumen (figur 2B, højre panel; se supplerende figur 2 for billeder af kohorter af GUV'er).
Figur 1: Eksperimentelle trin for inverteret emulsion. (1) Trin 2.3.1 til og med trin 2.3.3 i protokollen visualiseres for at demonstrere samlingen af lipidmonolaget ved grænsefladen mellem lipid-olieblandingen og den ydre bufferopløsning. (2) Visualisering af trin 2.3.5 i protokollen er vist her for at repræsentere dannelsen af lipidmonolaget omkring emulgerede dråber, der indkapsler den indre CFE-opløsning. (3) Trin 2.3.6 i protokollen viser tilsætningen af monolags GUV'er til mikrocentrifugerøret med lipidmonolaget ved grænsefladen mellem en lipid-olieblanding og en ydre bufferopløsning. (4) Trin 2.3.7 er afbildet her, hvor centrifugering fører til dannelse af en GUV-pellet i den ydre opløsning. (5) Trin 2.3.8 er vist her, der angiver processen med at fjerne den overskydende lipid-i-olie-blanding og den ydre opløsning. (6) Endelig er trin 2.3.9 afbildet her, hvor GUV-pelleten resuspenderes i den ydre opløsning, og GUV'erne er klar til inkubation efterfulgt af billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Proteinekspression i bulk CFE-reaktioner og i GUV'er, der indkapsler CFE-reaktioner. (A) Fluorescensudlæsninger af individuelle bulk CFE-reaktioner, der udtrykker WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP og opløselig sfGFP. Den opløselige sfGFP-graf repræsenterer signalet fra en 2,5 μL reaktion (standardreaktionsvolumen er 20 μL) for at undgå overmætning af pladelæsermålingerne. Data præsenteres som gennemsnit ± S.D., n = 3. (B) Venstre: Et repræsentativt konfokalt billede af en GUV-indkapsling CFE-reaktion, der udtrykker WT-GluR0-sfGFP. Midten: Et repræsentativt konfokalt billede af GUV'er, der indkapsler CFE-reaktion, der udtrykker PRSP-GluR0-sfGFP. Til højre: Et repræsentativt konfokalt billede af en GUV-indkapsling CFE-reaktion, der udtrykker opløselig sfGFP. Skalabjælker: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Kalibreringskurven for sfGFP-signalet og den tilhørende lineære regressionsanalyse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Repræsentativt konfokalt billede af kohorter af GUV'er, der udtrykker (venstre) WT-GluR0-sfGFP, (midterste) PRSP-GluR0-sfGFP og (højre) opløseligt sfGFP. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Aminosyresekvensen af vildtype- og proteorhodopsin-signalpeptider. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Koncentrationen af syntetiserede proteiner i bulk CFE-reaktioner. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stort set enhver cellulær proces, der afhænger af overførsel af molekyler eller information over cellemembranen, såsom cellesignalering eller celleexcitation, kræver membranproteiner. Således er rekonstituering af membranproteiner blevet den største flaskehals i realiseringen af forskellige syntetiske celledesigns til forskellige applikationer. Traditionel vaskemiddelmedieret rekonstitution af membranproteiner i biologiske membraner kræver GUV-genereringsmetoder såsom blid hævelse eller elektrodannelse. Hævelsesmetoder producerer normalt små vesikler, og elektrodannelsesudbyttet falder betydeligt, når komplicerede opløsninger, hvilket ofte er tilfældet ved generering af syntetiske celler, indkapsles32. Derudover opløser vaskemidler membranproteinet, og deres fjernelse under rekonstitutionsprocessen kan forårsage proteinfejlfoldning33,34. På den anden side er den tilgang, der præsenteres her, afhængig af den cotranslationelle inkorporering af membranproteinet i lipid-dobbeltlaget, som mere ligner den naturlige proteinbiogenesevej i celler22.
Fra et teknisk synspunkt er den præsenterede protokol fordelagtig i forhold til andre almindelige indkapslingsmetoder, såsom elektrodannelse og kontinuerlig dråbekrydsningsindkapsling 7,8,35,36 (cDICE), for lettere implementering, da det eneste laboratorieudstyr, der kræves til GUV-generering, er en centrifuge. I modsætning til elektrodannelse tillader den inverterede emulsionsmetode indkapsling af forskellige kombinationer af molekyler med forskellige koncentrationer. Sammenlignet med den oprindelige inverterede emulsionsteknik25 genererer denne tilgang desuden mere stabile GUV'er, der er egnede til indkapsling af CFE-lysater eller PURE-systemer. Den højere GUV-stabilitet skyldes tilstedeværelsen af diblokcopolymer i sammensætningen af GUV-membran37 samt den lange inkubation af olie-vand-grænsefladen, der gør det muligt at mætte grænsefladen med lipidmolekyler. Endelig, i modsætning til mikrofluidiske tilgange, kræver den protokol, der præsenteres her, ikke små kanaler og slanger. Derfor kan CFE-reaktionen indkapsles, så snart den er samlet, og den kortere tid for GUV-samling på grund af manglende flow og mulig tilstopning forhindrer for tidlig start af CFE-reaktionen. Mens demonstrationen af membranproteinekspression i denne protokol er eksklusiv for PUREfrec-reaktioner, kan man udvide denne metode til at syntetisere proteiner ved hjælp af forskellige tilgængelige CFE-systemer, såsom lysatbaserede bakterielle eller pattedyrs CFE-systemer.
Den præsenterede tilgang her har begrænsninger, der er forårsaget af den olieafhængige karakter af GUV-dannelsesprocessen og hensigten om at have stabile GUV'er. Denne tilgang er typisk længere sammenlignet med andre metoder, såsom cDICE eller mikrofluidik, på grund af den lange inkubationstid for olie-vand-grænsefladen, der kræves for grænsefladestabilisering og højt GUV-udbytte. Derudover er lipidsammensætningen primært begrænset til POPC med små doser af andre lipider eller blokcopolymerer, mens andre metoder, såsom elektrodannelse, er mere velegnede til inkorporering af lipider med forskellige fysiske og kemiske egenskaber. Mens GUV-membransammensætningen i denne metode er en blanding af POPC og PBD-PEO for at maksimere CFE-udbyttet, kan mulige variationer i GUV-membransammensætningen testes. Det kan dog være nødvendigt med yderligere optimering af parametrene for andre membranproteiner. Da dråbeemulgeringen sker gennem manuel pipettering, er de GUV'er, der genereres via denne metode, polydisperse og ret heterogene i størrelse. Ydermere kan det faktum, at lipider opløses i den organiske fase, lejlighedsvis forårsage et lag olie mellem de to foldere i GUV-membranen eller forurene billedkammeret med olie, der kan være skadeligt for billedkvaliteten. En mulig løsning på udfordringen med restolie er at erstatte mineralolie med et flygtigt organisk opløsningsmiddel, såsom diethylether, som vist af Tsumoto et al.38, for at stole på opløsningsmiddelfordampning sammen med centrifugering under GUV-dannelse.
Selvom der ikke er nogen demonstration af kanalfunktion i dette arbejde, inspireret af tidligere assays brugt til at undersøge rekonstitueret mekano- eller lysfølsom kanalfunktionalitet, er et fluorescensmikroskopibaseret assay skitseret. Åbningen af GluR0-kanalen rapporteres at øge membranledningsevnen for K+- ioner24. Fordi CFE-reaktioner allerede indeholder en høj koncentration af K+, vil typiske kaliumindikatorer ikke være egnede til at vurdere kanalfunktionalitet. Men fordi kaliumtilstrømning ændrer membranpotentialet, kan følsomme membranpotentialeindikatorer såsom DiBAC4(3)22 eller BeRST 139 rapportere GluR0-aktivitet i nærvær af glutamat.
En vellykket rekonstitution af membranproteiner i syntetiske celler åbner op for mange muligheder for at skabe syntetiske celler med hidtil usete evner, der i højere grad efterligner naturlige celler. En nuværende stor ulempe ved syntetiske celler er deres manglende evne til at reproducere og genbruge energi. Men med lys- og kemikalieafhængige energiregenereringsordninger, der er stærkt afhængige af membranproteiner, kan man forestille sig langtidsholdbare syntetiske celler40. Brug af CFE-systemer tillader rekonstituering af flere membranproteiner, der kollektivt kan udføre visse opgaver. For eksempel kan rekonstitution af en ligandstyret ionkanal svarende til GluR0 beskrevet her, sammen med forskellige spændingsstyrede ionkanaler, føre til konstruktionen af en excitabel neuronlignende syntetisk celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
APL anerkender støtte fra National Science Foundation (EF1935265), National Institutes of Health (R01-EB030031 og R21-AR080363) og Army Research Office (80523-BB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
| 96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
| Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
| Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
| Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
| Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
| PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
| pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
| PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
| Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
| Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
| VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
- Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
- Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
- Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
- Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
- Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
- Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
- Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
- Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
- Schneider, B., et al.
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
- Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
- Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
- Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
- Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
- Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
- Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
- Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
- Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
- Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
- Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
- van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
- Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
- Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).
