Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के encapsulation द्वारा बैक्टीरियल ग्लूटामेट रिसेप्टर चैनल का पुनर्गठन

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66595
Automatic Translation
*1,2, *3, 2,3,4,5
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल लिपिड बाइलेयर में एक मॉडल झिल्ली प्रोटीन के संश्लेषण और समावेश की जांच के लिए एक विशाल यूनिलामेलर पुटिका (जीयूवी) के भीतर एक सेल-फ्री अभिव्यक्ति (सीएफई) प्रणाली को समाहित करने के लिए उपयोग की जाने वाली उलटा पायस विधि का वर्णन करता है।

Abstract

सेल-फ्री एक्सप्रेशन (सीएफई) सिस्टम सिंथेटिक जीव विज्ञान में शक्तिशाली उपकरण हैं जो सिंथेटिक कोशिकाओं में बायोसेंसिंग और ऊर्जा पुनर्जनन जैसे सेलुलर कार्यों की बायोमिमिक्री की अनुमति देते हैं। सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के पुनर्निर्माण, हालांकि, सिंथेटिक कोशिकाओं की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन के सफल पुनर्गठन की आवश्यकता है। जबकि घुलनशील प्रोटीन की अभिव्यक्ति आमतौर पर आम सीएफई सिस्टम में सफल होती है, सिंथेटिक कोशिकाओं के लिपिड बाइलेयर में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। यहां, सिंथेटिक कोशिकाओं के अंदर सीएफई प्रतिक्रिया के एनकैप्सुलेशन और इनक्यूबेशन के आधार पर मॉडल सिंथेटिक कोशिकाओं के रूप में विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) में एक मॉडल झिल्ली प्रोटीन, बैक्टीरियल ग्लूटामेट रिसेप्टर (ग्लूआर 0) के पुनर्गठन के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया जाता है। इस मंच का उपयोग करते हुए, हाइब्रिड GUVs के झिल्ली में GluR0 के सफल cotranslational अनुवाद पर proteorhodopsin संकेत पेप्टाइड के साथ GluR0 के एन-टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड को प्रतिस्थापित करने का प्रभाव प्रदर्शित किया जाता है। यह विधि एक मजबूत प्रक्रिया प्रदान करती है जो सिंथेटिक कोशिकाओं में विभिन्न झिल्ली प्रोटीन के सेल-मुक्त पुनर्गठन की अनुमति देगी।

Introduction

बॉटम-अप सिंथेटिक जीवविज्ञान ने पिछले एक दशक में बायोइंजीनियरिंग, दवा वितरण और पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 में कई संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक उभरते क्षेत्र के रूप में बढ़ती रुचि प्राप्त की है। नीचे-ऊपर सिंथेटिक जीव विज्ञान की आधारशिला के रूप में सिंथेटिक कोशिकाओं के विकास, विशेष रूप से, सिंथेटिक कोशिकाओं के आशाजनक अनुप्रयोगों के साथ-साथ उनके सेल की तरह भौतिक और जैव रासायनिक गुणों है कि इन विट्रो biophysical अध्ययन 3,4,5,6 में सुविधा के कारण वैज्ञानिक समुदायों की एक विस्तृत श्रृंखला को आकर्षित किया है. सिंथेटिक कोशिकाओं को अक्सर सेल के आकार के विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) में इंजीनियर किया जाता है जिसमें विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को फिर से बनाया जाता है। सेल साइटोस्केलेटन 7,8, प्रकाश-निर्भर ऊर्जा पुनर्जनन9, सेलुलर संचार10,11, और बायोसेंसिंग12 का पुनर्गठन सिंथेटिक कोशिकाओं में सेल जैसे व्यवहार के पुनर्निर्माण के लिए किए गए प्रयासों के उदाहरण हैं।

जबकि कुछ सेलुलर प्रक्रियाएं घुलनशील प्रोटीन पर भरोसा करती हैं, प्राकृतिक कोशिकाओं की कई विशेषताएं, जैसे संवेदन और संचार, अक्सर आयन चैनल, रिसेप्टर्स और ट्रांसपोर्टर्स सहित झिल्ली प्रोटीन का उपयोग करती हैं। सिंथेटिक सेल विकास में एक बड़ी चुनौती झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन है। लिपिड bilayers में झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन के पारंपरिक तरीकों डिटर्जेंट मध्यस्थता शुद्धि पर भरोसा करते हैं, इस तरह के तरीकों श्रमसाध्य हैं, अभिव्यक्ति मेजबान के लिए विषाक्त हैं कि प्रोटीन के लिए अप्रभावी, या अक्सर GUVs13 में झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन के लिए अनुकूल नहीं हैं.

प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक वैकल्पिक विधि सेल-मुक्त अभिव्यक्ति (सीएफई) सिस्टम है। सीएफई सिस्टम सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली उपकरण रहा है जो सेल लाइसेट या शुद्ध प्रतिलेखन-अनुवाद मशीनरी14का उपयोग करके विभिन्न प्रोटीनों की इन विट्रो अभिव्यक्ति में अनुमति देता है। सीएफई सिस्टम को जीयूवी में भी समझाया जा सकता है, इस प्रकार कम्पार्टमेंटल प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं की अनुमति देता है जिन्हें विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है, जैसे कि प्रकाश-कटाई सिंथेटिक कोशिकाओं9 या मैकेनोसेंसिटिव बायोसेंसर15,16का निर्माण। पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति विधियों के अनुरूप, झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति सीएफई सिस्टम17 में चुनौतीपूर्ण है। एकत्रीकरण, मिसफोल्डिंग, और सीएफई सिस्टम में पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की कमी प्रमुख बाधाएं हैं जो सीएफई सिस्टम का उपयोग करके सफल झिल्ली प्रोटीन संश्लेषण में बाधा डालती हैं। सीएफई सिस्टम का उपयोग करके नीचे-ऊपर झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन की कठिनाई एक जटिल झिल्ली प्रोटीन जैवजनन मार्ग की अनुपस्थिति के कारण होती है जो सिग्नल पेप्टाइड्स, सिग्नल मान्यता कणों, ट्रांसलोकॉन और चैपरोनिंग अणुओं पर निर्भर करती है। हालांकि, हाल ही में, कई अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि अनुवाद के दौरान माइक्रोसोम या लिपोसोम जैसे झिल्लीदार संरचनाओं की उपस्थिति सफल झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति 18,19,20,21को बढ़ावा देती है। इसके अतिरिक्त, ईगल्सफील्ड एट अल और Steinküher एट अल झिल्ली प्रोटीन के एन टर्मिनस में संकेत पेप्टाइड्स के रूप में जाना जाता विशिष्ट हाइड्रोफोबिक डोमेन के शामिल होने से इसकी अभिव्यक्ति22,23 में काफी सुधार हो सकता है। कुल मिलाकर, इन अध्ययनों से पता चलता है कि सिंथेटिक कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन की चुनौती को दूर किया जा सकता है यदि प्रोटीन अनुवाद जीयूवी झिल्ली की उपस्थिति में होता है और यदि उचित एन-टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड का उपयोग किया जाता है।

यहां, जीयूवी में झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन के लिए पुनः संयोजक तत्वों (शुद्ध) सीएफई प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके प्रोटीन संश्लेषण के एनकैप्सुलेशन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। बैक्टीरियल ग्लूटामेट रिसेप्टर24 (GluR0) को मॉडल झिल्ली प्रोटीन के रूप में चुना जाता है, और इसके झिल्ली पुनर्गठन पर इसके एन-टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड के प्रभाव का अध्ययन किया जाता है। प्रोटियोरोडोप्सिन सिग्नल पेप्टाइड का प्रभाव, जिसे ईगल्सफील्ड एट अल.22द्वारा झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन दक्षता में सुधार करने के लिए दिखाया गया था, की जांच पीआरएसपी-ग्लूआर 0 के रूप में निरूपित ग्लूआर 0 के उत्परिवर्तित संस्करण के निर्माण से की जाती है और जंगली प्रकार के ग्लूआर 0 के साथ इसकी अभिव्यक्ति और झिल्ली स्थानीयकरण (इसके बाद डब्ल्यूटी-ग्लूआर 0 के रूप में संदर्भित) जो इसके मूल सिग्नल पेप्टाइड की तुलना में है। यह प्रोटोकॉल उल्टे पायस विधि25 संशोधनों के साथ आधारित है जो इसे सीएफई एनकैप्सुलेशन के लिए मजबूत बनाता है। प्रस्तुत विधि में, सीएफई प्रतिक्रियाओं को पहले लिपिड-इन-ऑयल समाधान का उपयोग करके पायसीकृत किया जाता है जो माइक्रोन आकार की बूंदों को उत्पन्न करता है जिसमें सीएफई प्रणाली होती है और लिपिड मोनोलेयर द्वारा स्थिर होती है। पायस की बूंदों को तब एक तेल-पानी इंटरफ़ेस के शीर्ष पर स्तरित किया जाता है जो एक और लिपिड मोनोलेयर के साथ संतृप्त होता है। पायस की बूंदों को तब केन्द्रापसारक बल के माध्यम से तेल-पानी के इंटरफेस में यात्रा करने के लिए मजबूर किया जाता है। इस प्रक्रिया के माध्यम से, बूंदें एक और मोनोलेयर प्राप्त करती हैं, इस प्रकार एक बाइलेयर लिपिड पुटिका उत्पन्न होती है। सीएफई प्रतिक्रिया वाले जीयूवी को तब ऊष्मायन किया जाता है, जिसके दौरान झिल्ली प्रोटीन व्यक्त किया जाता है और जीयूवी झिल्ली में शामिल किया जाता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल GluR0 के सेल मुक्त अभिव्यक्ति के लिए निर्दिष्ट है, यह अन्य झिल्ली प्रोटीन या साइटोस्केलेटन पुनर्गठन या झिल्ली संलयन अध्ययन26 के रूप में विभिन्न सिंथेटिक सेल अनुप्रयोगों के सेल मुक्त संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन के लिए उपयोग किए गए अभिकर्मकों और उपकरणों को सामग्री की तालिका में प्रदान किया गया है।

1. छोटे यूनिलामेलर पुटिकाओं (एसयूवी) की उपस्थिति में थोक सीएफई प्रतिक्रियाएं

  1. एसयूवी की तैयारी
    नोट: इस कदम को क्लोरोफॉर्म के साथ काम करने के लिए सुरक्षा निर्देशों का पालन करते हुए एक धूआं हुड में प्रदर्शन करने की आवश्यकता है।
    1. क्लोरोफॉर्म में भंग 25 मिलीग्राम/एमएल पीओपीसी स्टॉक समाधान के 76 माइक्रोन को स्थानांतरित करके एक ग्लास शीशी में 5 एमएम 1-पामिटॉयल-2-ओलेओयल-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलिन (पीओपीसी) एसयूवी तैयार करें।
    2. धीरे कांच की शीशी घूर्णन करते हुए, तल पर सूखे लिपिड की एक फिल्म बनाने के लिए शीशी में आर्गन की एक कोमल धारा उड़ा. अगला, कांच की शीशी को एक desiccator में स्थानांतरित करें, जिसकी टोपी अतिरिक्त क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करने के लिए शिथिल रूप से खराब हो गई है।
    3. 1 घंटे के लिए desiccator में कांच की शीशी रखें. फिर, लगभग 2 मिनट के लिए लिपिड फिल्म और भंवर भंग करने के लिए 0.5 एमएल अल्ट्रा शुद्ध विआयनीकृत पानी जोड़ें।
    4. विआयनीकृत पानी में दो फिल्टर समर्थन भिगोकर और उन्हें आंतरिक झिल्ली समर्थन में से प्रत्येक पर रखकर एक मिनी बाहर निकालना उपकरण स्थापित करें. फिर, एक 100 एनएम पॉली कार्बोनेट फिल्टर भिगोएँ और यह दो आंतरिक झिल्ली एक्सट्रूडर बाहरी आवरण और अनुचर अखरोट द्वारा एक साथ आयोजित समर्थन करता है के बीच में जगह है. इस सेटअप को एक्सट्रूडर स्टैंड में रखें।
    5. अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी के साथ दो 1 एमएल गैस-तंग सीरिंज 3 बार फ्लश करें।
    6. लिपिड-पानी के मिश्रण का नमूना 1 एमएल गैस-तंग सीरिंज में से एक में लोड करें और इसे जगह में सिरिंज रखने के लिए स्विंग आर्म क्लिप का उपयोग करके मिनी एक्सट्रूडर के एक छोर में रखें। मिनी-एक्सट्रूडर के दूसरे छोर में दूसरी सिरिंज डालें और सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से उदास है।
      नोट: लिपिड-पानी मिश्रण के साथ सिरिंज लोड करते समय, सुनिश्चित करें कि मिनी-एक्सट्रूडर के माध्यम से गुजरने से पहले सिरिंज में कोई हवा नहीं है।
    7. धीरे मिनी बाहर निकालना तंत्र के माध्यम से खाली सिरिंज के लिए मूल सिरिंज से लिपिड-पानी मिश्रण पारित. एसयूवी बनाने के लिए इस चरण को 11 बार दोहराएं। एसयूवी को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: एसयूवी समाधान को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. सीएफई प्रतिक्रिया विधानसभा
    1. निम्नलिखित में विस्तृत मामूली संशोधनों के साथ निर्माता द्वारा प्रदान किए गए सेल-फ्री अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल का पालन करके सीएफई प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें।
    2. समाधान 1 के 10 माइक्रोन मिलाएं (अमीनो एसिड, एनटीपी, टीआरएनए और एंजाइमों के लिए सब्सट्रेट, और आवश्यक बफर युक्त), समाधान 2 के 1 माइक्रोन (20% ग्लिसरॉल में प्रोटीन), समाधान 3 के 2 माइक्रोन (राइबोसोम (20 माइक्रोन)), घुलनशील एसएफजीएफपी-एसएफचेरी (1-10) 27 (इसके बाद घुलनशील एसएफजीएफपी के रूप में संदर्भित), डब्ल्यूटी-ग्लूआर 0-एसएफजीएफपी, या पीआरएसपी-ग्लूआर 0-एसएफजीएफपी (10-60 एनजी / 1000 बेस जोड़े) के लिए डीएनए एन्कोडिंग की उचित मात्रा, 1 μL murine RNAse अवरोधक, और झिल्ली प्रोटीन के लिए 5 मिमी एसयूवी समाधान के 4 μL या घुलनशील प्रोटीन के लिए 4 μL पानी।
    3. अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी जोड़कर प्रतिक्रिया की अंतिम मात्रा को 20 माइक्रोन तक लाएं।
      नोट: सीएफई सिस्टम को असेंबल करते समय, सभी घटकों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। सभी सामग्रियां तापमान के प्रति संवेदनशील होती हैं और कमरे के तापमान तक पहुंचने पर नीचा दिखा सकती हैं।
  3. सीएफई प्रतिक्रिया इनक्यूबेशन और निगरानी
    1. सीएफई समाधान को 96-अच्छी तरह से शंक्वाकार वी-नीचे प्लेट में स्थानांतरित करें। प्रतिक्रिया के पाठ्यक्रम के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए, एक सील फिल्म का उपयोग कर थाली को कवर.
    2. 4-5 घंटे के लिए प्लेट रीडर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट इनक्यूबेट करें, जबकि हर 2 मिनट में 488 एनएम/528 एनएम उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर 100 के लाभ के साथ जीएफपी सिग्नल को मापकर सीएफई प्रतिक्रिया की निगरानी करें।

2. GUVs में समाहित CFE प्रतिक्रियाएं

  1. GUV बाहरी बफर समाधान की तैयारी
    1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 1 एम शुक्राणु के 1.5 माइक्रोन, 100 एमएम एटीपी के 37.5 माइक्रोन, 100 एमएम जीटीपी के 25 माइक्रोन, 100 एमएम सीटीपी के 12.5 माइक्रोन, 100 एमएम यूटीपी के 12.5 माइक्रोन, 1 एम क्रिएटिन फॉस्फेट के 25 माइक्रोन, 1 एम मैग्नीशियम एसीटेट के 18 माइक्रोन, 3 एम पोटेशियम ग्लूटामेट के 93.33 माइक्रोन को मिलाएं, 1 एम हेप्स कोह (पीएच 7.4) के 50 माइक्रोन, 332 एमएम फोलिनिक एसिड के 1.15 माइक्रोन, 2 एम ग्लूकोज के 100 माइक्रोन, और 20 अमीनो एसिड में से प्रत्येक के 6 एमएम मिश्रण के स्टॉक समाधान से 50 माइक्रोन (सूर्य एट अल.28द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके तैयार)।
    2. अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी जोड़कर समाधान की अंतिम मात्रा को 1 एमएल तक लाएं।
      नोट: सभी घटकों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। अमीनो एसिड की कमी से बचने के लिए अंत में अमीनो एसिड मिश्रण जोड़ें28. समाधान को 330 माइक्रोन एलिकोट में एलिकोट किया जा सकता है और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. लिपिड-इन-तेल मिश्रण की तैयारी
    नोट: इस कदम को क्लोरोफॉर्म के साथ काम करने के लिए सुरक्षा निर्देशों का पालन करते हुए एक धूआं हुड में प्रदर्शन करने की आवश्यकता है।
    1. एक धूआं हुड में, 25 मिलीग्राम/एमएल पीओपीसी स्टॉक समाधान के 17.3 माइक्रोन और 50 मिलीग्राम/एमएल पॉली (ब्यूटाडीन) -बी-पॉली (एथिलीन ऑक्साइड) (पीईओ-बी-पीबीडी) कॉपोलीमर के 1.08 माइक्रोन को 15 एमएल ग्लास शीशी में मिलाएं।
      नोट: अंतिम लिपिड-इन-ऑयल समाधान में क्रमशः 95% और 5% पीओपीसी और पीईओ-बी-पीबीडी के साथ 0.5 एमएम लिपिड होता है। पीईओ-बी-पीबीडी प्रोटीन अभिव्यक्ति के दौरान झिल्ली स्थिरता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन लिपिड अणुओं29,30 से अलग मिसेल में एकत्रित करने के लिए कॉपोलीमर की प्रवृत्ति को कम करने के लिए एक कम दाढ़ अनुपात में रखा गया था।
    2. ध्यान से कांच की शीशी में आर्गन गैस की एक कोमल धारा उड़ा, जबकि क्लोरोफॉर्म वाष्पित करने के लिए शीशी घूर्णन.
    3. सूखे लिपिड युक्त 15 एमएल ग्लास शीशी में हल्के खनिज तेल के पिपेट 1.2 एमएल।
    4. लिपिड और तेल को 10-20 s के लिए अधिकतम गति से भंवर करके मिलाएं। भंग लिपिड-कॉपोलीमर मिश्रण बादल दिखाई देगा।
    5. यह सुनिश्चित करने के लिए कि तेल में सभी संभव लिपिड समुच्चय पूरी तरह से भंग कर रहे हैं और पूरे तेल में फैले हुए हैं, कांच की शीशी को अधिकतम गति से अतिरिक्त 10-20 एस के लिए भंवर करने से पहले 20 मिनट के लिए लगभग 50 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।
  3. सीएफई प्रतिक्रिया विधानसभा और एनकैप्सुलेशन (चित्रा 1 निम्नलिखित चरणों को सारांशित करता है)।
    1. चरण 2.1 में तैयार सीएफई बाहरी बफर समाधान के 270 माइक्रोन, 5 एम एनसीएल के 15 माइक्रोन और 4.5 एम केसीएल के 15 माइक्रोन में तैयार सीएफई बाहरी बफर समाधान के 270 माइक्रोन को मिलाकर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जीयूवी बाहरी समाधान के 300 माइक्रोन तैयार करें।
      नोट: इस चरण में, जीयूवी बाहरी समाधान में 1 एम 1,4-डाइथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) के 0.45 माइक्रोन जोड़ें। NaCl और KCl को जोड़ने का उद्देश्य बाहरी समाधान की परासरण को आंतरिक CFE समाधान के साथ मिलान करने के लिए समायोजित करना है। NaCl और KCl की सटीक मात्रा वांछित परासरण समायोजन पर निर्भर करती है। परासरण को समायोजित करने के लिए कोई भी NaCl या KCl या दोनों जोड़ सकता है।
    2. जीयूवी बाहरी समाधान के शीर्ष पर लिपिड-इन-तेल मिश्रण के धीरे से 300 माइक्रोन विंदुक।
      नोट: लिपिड-तेल मिश्रण जोड़ते समय, यह महत्वपूर्ण है कि तेल जलीय बाहरी समाधान के साथ मिश्रण न करे। इसके अलावा, लिपिड-इन-तेल मिश्रण और जीयूवी बाहरी समाधान के बीच एक दृश्य इंटरफ़ेस होना चाहिए।
    3. लिपिड मोनोलेयर को इंटरफ़ेस पर बनाने और स्थिर करने की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर तेल-पानी इंटरफ़ेस को इनक्यूबेट करें।
    4. इस बीच, झिल्ली प्रोटीन वेरिएंट या घुलनशील जीएफपी एन्कोडिंग प्लाज्मिड डीएनए युक्त एक सीएफई प्रतिक्रिया को इकट्ठा करने के लिए खंड 1.2.1 का पालन करें। 5 एमएम एसयूवी समाधान या पानी के 4 माइक्रोन को 1 एम सुक्रोज के 4 माइक्रोन से बदलें। यह प्रतिक्रिया GUV आंतरिक समाधान होगी।
      नोट: आंतरिक और बाहरी समाधानों की परासरण को मापने के लिए एक ऑस्मोमीटर का उपयोग किया गया था। बाहरी समाधान की परासरता को तब NaCl या पानी के अतिरिक्त द्वारा तदनुसार समायोजित किया गया था। सीएफई प्रतिक्रिया का परासरण आमतौर पर लगभग 1600 एमओएसएम/किग्रा होता है। प्रतिक्रिया में सुक्रोज जोड़ने से आंतरिक समाधान घनत्व बढ़ जाता है, इस प्रकार पुटिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान तेल-पानी के इंटरफेस में यात्रा करने की अनुमति मिलती है। सुक्रोज का एक विकल्प ऑप्टि-प्रेप घनत्व ढाल समाधान है।
    5. लिपिड-इन-ऑयल समाधान में प्रतिक्रिया को पायसीकारी करने और सिंथेटिक कोशिकाओं के चारों ओर लिपिड मोनोलेयर बनाने के लिए ~ 1 मिन के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और पिपेट युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लिपिड-तेल मिश्रण के 600 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: अंतिम समाधान किसी भी बुलबुले नहीं होना चाहिए और अपारदर्शी दिखना चाहिए.
    6. धीरे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तेल परत के शीर्ष पर आंतरिक समाधान पायस को विंदुक करें जहां तेल-पानी इंटरफ़ेस स्थापित किया गया था।
      नोट: सावधान रहें कि इंटरफ़ेस को परेशान या अस्थिर न करें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
      नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन गति इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित की गई थी। Adir et al.31 ने एक अलग सेंट्रीफ्यूजेशन गति की सूचना दी।
    8. एक बार सेंट्रीफ्यूजेशन खत्म हो जाने के बाद, एक पिपेटर का उपयोग करके माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से अतिरिक्त तेल और बाहरी समाधान को ध्यान से हटा दें। बाहरी समाधान निकालें जब तक शेष मात्रा 100 माइक्रोन के आसपास न हो।
      नोट: जीयूवी की एक गोली आमतौर पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे दिखाई देती है। हालांकि, एक दृश्यमान गोली की कमी का मतलब यह नहीं है कि कोई जीयूवी उपज नहीं है। एक पिपेटर का उपयोग करने के बजाय, बाहरी समाधान के शीर्ष पर अतिरिक्त तेल को आकांक्षा द्वारा हटाया जा सकता है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि लिपिड-इन-ऑयल समाधान पूरी तरह से हटा दिया गया है। GUV समाधान में तेल संदूषण निम्न-गुणवत्ता वाली छवियों का कारण बन सकता है।
    9. धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा शेष 100 माइक्रोन समाधान में GUV गोली resuspend. अगला, सेते करने के लिए एक साफ 96 अच्छी तरह से स्पष्ट फ्लैट नीचे प्लेट के लिए GUV समाधान हस्तांतरण.

3. समझाया सीएफई प्रतिक्रिया इनक्यूबेशन और इमेजिंग

  1. वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक सील फिल्म का उपयोग कर थाली को कवर. 5-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। एक थाली रीडर का उपयोग करें और इनक्यूबेशन कदम के लिए थाली पाठक तैयार करने के लिए कदम 1.3.2 का पालन कर सकते हैं.
  2. एक बार इनक्यूबेशन खत्म हो जाने के बाद, ईएमसीसीडी कैमरा (या एससीएमओएस कैमरा), डीएक्यू-एमएक्स नियंत्रित लेजर (या एक एकीकृत लेजर कॉम्बिनर सिस्टम), और एक सीएसयू-एक्स 1 कताई डिस्क कॉन्फोकल (या एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल) से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप के इमेजिंग चरण पर 96 अच्छी तरह से प्लेट रखें। GUVs युक्त किसी भी ROI पर ध्यान केंद्रित करें और Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA उद्देश्य का उपयोग करके 488 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर छवियों को कैप्चर करें।
  3. GUVs की छवियों को .tiff प्रारूप में सहेजें।
  4. छवियों को इमेज प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर (जैसे, ImageJ या फिजी) में खोलें। ब्राइटनेस/कंट्रास्ट सेटिंग पैनल खोलें। फ्लोरोसेंट प्रोटीन दृश्यमान बनाने कि उचित सेटिंग्स के लिए चमक और इसके विपरीत समायोजित करें.
  5. लक्ष्य अलग व्यक्त प्रोटीन के संकेत तीव्रता की तुलना करने के लिए है, पहले ढेर ढेर सबमेनू के तहत स्थित स्टैक पैनल के लिए छवियों का उपयोग कर विभिन्न प्रोटीन युक्त GUVs > अलग-अलग छवियों. फिर, ब्राइटनेस/कंट्रास्ट पैनल का उपयोग करके सभी छवियों की चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सीएफई प्रतिक्रियाओं के एनकैप्सुलेशन से पहले, ग्लूआर 0-एसएफजीएफपी के दो वेरिएंट देशी और प्रोटीरोडोप्सिन सिग्नल पेप्टाइड्स (सिग्नल पेप्टाइड अनुक्रम पूरक तालिका 1 में प्रस्तुत किए जाते हैं) को परेशान करते हैं, और घुलनशील एसएफजीएफपी व्यक्तिगत रूप से थोक प्रतिक्रियाओं में व्यक्त किए गए थे, और उनकी अभिव्यक्ति की निगरानी की गई थी एक प्लेट रीडर (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके एसएफजीएफपी सिग्नल का पता लगाकर). झिल्ली प्रोटीन अनुपस्थिति या 100 एनएम एसयूवी की उपस्थिति में व्यक्त किए गए थे। इसके अतिरिक्त, एक अंशांकन वक्र का उपयोग करना जो एसएफजीएफपी संकेत को अपनी एकाग्रता (अनुपूरक चित्रा 1) से संबंधित करता है, संश्लेषित प्रोटीन की सांद्रता का अनुमान लगाया गया था (पूरक तालिका 2)। स्पष्ट रूप से, घुलनशील एसएफजीएफपी में सभी तीन प्रोटीनों में उच्चतम अभिव्यक्ति थी, जो बताती है कि झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति सीएफई प्रणाली पर बोझ डालती है, इस प्रकार प्रतिक्रिया को धीमा कर देती है और इसकी उपज कम हो जाती है। इसके अलावा, औसतन, एसयूवी की उपस्थिति में झिल्ली प्रोटीन व्यक्त करने वाली प्रतिक्रियाओं ने एसयूवी की कमी वाली प्रतिक्रियाओं की तुलना में उच्च एसएफजीएफपी संकेत दिखाया। यह अवलोकन Steinküher एट अल के निष्कर्षों के साथ संरेखित है, जो पता चला है कि झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोटीन23 का उत्पादन करने के लिए सीएफई सिस्टम की क्षमता कम कर देता है. फिर भी, थोक सीएफई प्रतिक्रिया में प्रोटीन अभिव्यक्ति के सफल प्रदर्शन को देखते हुए, कोई यह तर्क दे सकता है कि समझाया गया सीएफई जीयूवी के अंदर प्रोटीन को भी संश्लेषित करेगा।

इसके बाद, व्यक्तिगत सीएफई प्रतिक्रियाओं को जीयूवी में उल्टे पायस विधि का उपयोग करके ग्लूआर 0, अर्थात् डब्ल्यूटी-ग्लूआर 0, पीआरएसपी-ग्लूआर 0, और घुलनशील एसएफजीएफपी के वेरिएंट को व्यक्त करने के लिए समझाया गया था। जबकि WT-GluR0, GluR0 देशी सिग्नल पेप्टाइड को आश्रय देते हुए, उत्कृष्ट अभिव्यक्ति और झिल्ली स्थानीयकरण(चित्रा 2B, बाएं पैनल) का प्रदर्शन किया, इसके समकक्ष, PRSP-GluR0, जिसमें प्रोटियोरोडोप्सिन एन-टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड है, ने समान मजबूत झिल्ली स्थानीयकरण नहीं दिखाया। पीआरएसपी-ग्लूआर 0 एकत्रीकरण और पंचर गठन (चित्रा 2 बी, मध्य पैनल) के लिए अधिक प्रवण पाया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, घुलनशील एसएफजीएफपी जीयूवी में व्यक्त किया गया था और जीयूवी लुमेन (चित्रा 2बी, दाएं पैनल; जीयूवी के साथियों की छवियों के लिए पूरक चित्रा 2 देखें) में रहा।

Figure 1
चित्रा 1: उलटा पायस के प्रायोगिक कदम। (1) प्रोटोकॉल के चरण 2.3.3 के माध्यम से चरण 2.3.1 लिपिड-तेल मिश्रण और बाहरी बफर समाधान के इंटरफेस पर लिपिड मोनोलेयर की विधानसभा को प्रदर्शित करने के लिए कल्पना की जाती है। (2) प्रोटोकॉल के चरण 2.3.5 का दृश्य आंतरिक सीएफई समाधान को समाहित करने वाली पायसीकृत बूंदों के आसपास लिपिड मोनोलेयर के गठन का प्रतिनिधित्व करने के लिए यहां दिखाया गया है। (3) प्रोटोकॉल का चरण 2.3.6 लिपिड-तेल मिश्रण और बाहरी बफर समाधान के इंटरफेस पर लिपिड मोनोलेयर के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मोनोलेयर जीयूवी के अलावा दिखाता है। (4) चरण 2.3.7 को यहां दर्शाया गया है, जिसमें सेंट्रीफ्यूजेशन बाहरी समाधान में जीयूवी गोली के गठन की ओर जाता है। (5) चरण 2.3.8 यहां दिखाया गया है, जो अतिरिक्त लिपिड-इन-तेल मिश्रण और बाहरी समाधान को हटाने की प्रक्रिया को दर्शाता है। (6) अंत में, चरण 2.3.9 को यहां दर्शाया गया है, जहां बाहरी समाधान में जीयूवी गोली को फिर से निलंबित कर दिया गया है, और जीयूवी इनक्यूबेशन के लिए तैयार हैं, इसके बाद इमेजिंग है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: थोक सीएफई प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति और जीयूवी में सीएफई प्रतिक्रियाओं को समाहित करना। (ए) डब्ल्यूटी-ग्लूआर0-एसएफजीएफपी, पीआरएसपी-ग्लूआर0-एसएफजीएफपी, और घुलनशील एसएफजीएफपी व्यक्त करने वाली व्यक्तिगत थोक सीएफई प्रतिक्रियाओं के प्रतिदीप्ति रीडआउट। घुलनशील sfGFP ग्राफ प्लेट रीडर माप के अतिसंतृप्ति से बचने के लिए 2.5 माइक्रोन प्रतिक्रिया (मानक प्रतिक्रिया मात्रा 20 माइक्रोन है) से संकेत का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को S.D, n = 3 ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (बी) बाएं: डब्ल्यूटी-ग्लूआर0-एसएफजीएफपी को व्यक्त करने वाली सीएफई प्रतिक्रिया को एनकैप्सुलेटिंग करने वाली जीयूवी की एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि। मध्य: PRSP-GluR0-sfGFP व्यक्त CFE प्रतिक्रिया encapsulating GUVs की एक प्रतिनिधि confocal छवि. दाएं: घुलनशील एसएफजीएफपी व्यक्त करने वाली सीएफई प्रतिक्रिया को एनकैप्सुलेट करने वाली जीयूवी की एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि। स्केल सलाखों: 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 1: sfGFP संकेत अंशांकन वक्र और इसके इसी रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: (बाएं) डब्ल्यूटी-ग्लूआर0-एसएफजीएफपी, (मध्य) पीआरएसपी-ग्लूआर0-एसएफजीएफपी, और (दाएं) घुलनशील एसएफजीएफपी व्यक्त करने वाले जीयूवी के साथियों की प्रतिनिधि फोकल छवि। स्केल बार: 10 माइक्रोन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: जंगली प्रकार और प्रोटीरोडोप्सिन सिग्नल पेप्टाइड्स का अमीनो एसिड अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: थोक सीएफई प्रतिक्रियाओं में संश्लेषित प्रोटीन की एकाग्रता। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वस्तुतः किसी भी सेलुलर प्रक्रिया जो कोशिका झिल्ली में अणुओं या सूचनाओं के हस्तांतरण पर निर्भर करती है, जैसे सेल सिग्नलिंग या सेल उत्तेजना, झिल्ली प्रोटीन की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए विभिन्न सिंथेटिक सेल डिजाइनों को साकार करने में मुख्य बाधा बन गया है। जैविक झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन के पारंपरिक डिटर्जेंट-मध्यस्थता पुनर्गठन के लिए कोमल सूजन या इलेक्ट्रोफॉर्मेशन जैसे जीयूवी पीढ़ी के तरीकों की आवश्यकता होती है। सूजन दृष्टिकोण आमतौर पर छोटे आकार पुटिकाओं का उत्पादन, और electroformation उपज काफी गिर जाता है जब जटिल समाधान, जो अक्सर मामला है जब सिंथेटिक कोशिकाओं को पैदा करते हैं,32 समझाया जाता है. इसके अतिरिक्त, डिटर्जेंट झिल्ली प्रोटीन घुलनशील, और पुनर्गठन प्रक्रिया के दौरान उनके हटाने प्रोटीनmisfolding 33,34 कारण हो सकता है. दूसरी ओर, यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण लिपिड बाइलेयर में झिल्ली प्रोटीन के कोट्रांसलेशनल समावेश पर निर्भर करता है, जो कोशिकाओं22 में प्राकृतिक प्रोटीन जैवजनन मार्ग जैसा दिखता है।

तकनीकी दृष्टिकोण से, प्रस्तुत प्रोटोकॉल अन्य सामान्य एनकैप्सुलेशन विधियों के लिए फायदेमंद है, जैसे कि इलेक्ट्रोफॉर्मेशन और निरंतर छोटी बूंद इंटरफ़ेस क्रॉसिंग एनकैप्सुलेशन 7,8,35,36 (सीडीआईसीई), आसान कार्यान्वयन के लिए क्योंकि जीयूवी पीढ़ी के लिए आवश्यक एकमात्र प्रयोगशाला उपकरण एक अपकेंद्रित्र है। इलेक्ट्रोफॉर्मेशन के विपरीत, उलटा पायस विधि विभिन्न सांद्रता वाले अणुओं के विभिन्न संयोजनों के एनकैप्सुलेशन की अनुमति देती है। इसके अतिरिक्त, मूल उलटा पायस तकनीक25 की तुलना में, यह दृष्टिकोण अधिक स्थिर जीयूवी उत्पन्न करता है जो सीएफई लाइसेट्स या प्योर सिस्टम के एनकैप्सुलेशन के लिए उपयुक्त हैं। उच्च GUV स्थिरता GUV झिल्ली37 की संरचना में डिब्लॉक कॉपोलीमर की उपस्थिति के साथ-साथ तेल-पानी इंटरफ़ेस के लंबे इनक्यूबेशन के कारण होती है जो इंटरफ़ेस को लिपिड अणुओं के साथ संतृप्त करने की अनुमति देती है। अंत में, माइक्रोफ्लुइडिक्स दृष्टिकोण के विपरीत, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को छोटे चैनलों और टयूबिंग की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, सीएफई प्रतिक्रिया को इकट्ठा होते ही समझाया जा सकता है, और प्रवाह की कमी और संभावित क्लॉगिंग के कारण जीयूवी विधानसभा का कम समय सीएफई प्रतिक्रिया की समय से पहले शुरुआत को रोकता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन PUREfrex प्रतिक्रियाओं के लिए अनन्य है, एक इस विधि का विस्तार कर सकते हैं इस तरह के lysate आधारित बैक्टीरियल या स्तनधारी सीएफई सिस्टम के रूप में विभिन्न उपलब्ध सीएफई प्रणालियों, का उपयोग कर प्रोटीन संश्लेषित करने के लिए.

यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की सीमाएं हैं जो जीयूवी गठन प्रक्रिया की तेल-निर्भर प्रकृति और स्थिर जीयूवी के इरादे के कारण होती हैं। यह दृष्टिकोण आमतौर पर अन्य तरीकों की तुलना में लंबा होता है, जैसे कि सीडीआईसीई या माइक्रोफ्लुइडिक्स, तेल-पानी इंटरफेस के लंबे इनक्यूबेशन समय के कारण जो इंटरफ़ेस स्थिरीकरण और उच्च जीयूवी उपज के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, लिपिड संरचना मुख्य रूप से अन्य लिपिड या ब्लॉक कॉपोलिमर की छोटी खुराक के साथ पीओपीसी तक सीमित है, जबकि अन्य तरीके, जैसे इलेक्ट्रोफॉर्मेशन, विभिन्न भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ लिपिड के समावेश के लिए अधिक अनुकूल हैं। जबकि इस विधि में जीयूवी झिल्ली संरचना सीएफई उपज को अधिकतम करने के लिए पीओपीसी और पीबीडी-पीईओ का मिश्रण है, जीयूवी झिल्ली संरचना में संभावित बदलावों का परीक्षण किया जा सकता है। हालांकि, अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए मापदंडों के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। चूंकि छोटी बूंद पायसीकरण मैनुअल पाइपिंग के माध्यम से होता है, इसलिए इस विधि के माध्यम से उत्पन्न जीयूवी पॉलीडिस्पर्स और आकार में काफी विषम होते हैं। इसके अलावा, तथ्य यह है कि लिपिड कार्बनिक चरण में भंग कर रहे हैं कभी-कभी GUV झिल्ली के दो पत्रक के बीच तेल की एक परत पैदा कर सकता है या छवि गुणवत्ता के लिए हानिकारक हो सकता है कि तेल के साथ इमेजिंग कक्ष दूषित. अवशिष्ट तेल की चुनौती के लिए एक संभावित समाधान खनिज तेल को एक अस्थिर कार्बनिक विलायक के साथ बदलना है, जैसे कि डायथाइल ईथर, जैसा कि त्सुमोतो एट अल.38द्वारा दिखाया गया है, जीयूवी गठन के दौरान सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ विलायक वाष्पीकरण पर भरोसा करने के लिए।

जबकि इस काम में चैनल फ़ंक्शन का कोई प्रदर्शन नहीं है, पुनर्गठित मेचानो- या प्रकाश-संवेदनशील चैनल कार्यक्षमता की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले पिछले परख से प्रेरित है, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी-आधारित परख को रेखांकित किया गया है। GluR0 चैनल के उद्घाटन कश्मीर + आयनों24 के लिए झिल्ली चालकता में वृद्धि करने के लिए सूचित किया है. क्योंकि सीएफई प्रतिक्रियाओं में पहले से ही कश्मीर + की उच्च सांद्रता होती है, इसलिए विशिष्ट पोटेशियम संकेतक चैनल कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए उपयुक्त नहीं होंगे। हालांकि, क्योंकि पोटेशियम प्रवाह झिल्ली क्षमता को बदलता है, संवेदनशील झिल्ली संभावित संकेतक जैसे कि DiBAC4(3)22 या BeRST 139 ग्लूटामेट की उपस्थिति में GluR0 गतिविधि की रिपोर्ट कर सकते हैं।

सिंथेटिक कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन का सफल पुनर्गठन अभूतपूर्व क्षमताओं के साथ सिंथेटिक कोशिकाओं को बनाने के लिए कई संभावनाएं खोलता है जो प्राकृतिक कोशिकाओं की अधिक बारीकी से नकल करते हैं। सिंथेटिक कोशिकाओं का एक वर्तमान प्रमुख नुकसान ऊर्जा को पुन: पेश करने और रीसायकल करने में असमर्थता है। हालांकि, प्रकाश और रासायनिक निर्भर ऊर्जा पुनर्जनन योजनाओं है कि झिल्ली प्रोटीन पर भारी भरोसा के साथ, एक लंबे समय तक चलने सिंथेटिक कोशिकाओं40 परिकल्पना कर सकते हैं. सीएफई सिस्टम का उपयोग कई झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन की अनुमति देता है जो सामूहिक रूप से कुछ कार्य कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यहां वर्णित GluR0 के समान एक लिगैंड-गेटेड आयन चैनल का पुनर्गठन, विभिन्न वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों के साथ, एक उत्तेजक न्यूरॉन जैसी सिंथेटिक सेल के निर्माण का कारण बन सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

एपीएल राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (EF1935265), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01-EB030031 और R21-AR080363), और सेना अनुसंधान कार्यालय (80523-BB) से समर्थन स्वीकार करता है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 nm polycarbonate filter STERLITECH 1270193
96 Well Clear Bottom Plate ThermoFisher Scientific 165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader Agilent 11-120-533
Creatine phosphate Millipore Sigma 10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit Yokogawa CSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep) Millipore Sigma D1556 Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports Avanti 610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrate Millipore Sigma F7878
Glucose Millipore Sigma 158968
HEPES Millipore Sigma H3375
iXon X3 camera  Andor DU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1501
Light mineral oil Millipore Sigma M5904
Magnesium acetate tetrahydrate  Millipore Sigma M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) Avanti 610020
Olympus IX81 Inverted Microscope  Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective  Olympus 1-U2B933 
PEO-b-PBD Polymer Source P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
POPC lipid in chloroform  Avanti 850457C
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
PUREfrex 2.0 Cosmo Bio USA GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set New England BioLabs N0450
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs M0314S
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride Millipore Sigma S9888
Spermidine Millipore Sigma S2626
Sucrose Millipore Sigma S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 ELITechGroup VAPRO 5600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

Tags

कीवर्ड: सेल मुक्त अभिव्यक्ति झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन ग्लूटामेट रिसेप्टर विशालकाय Unilamellar Vesicles Proteorhodopsin संकेत पेप्टाइड सिंथेटिक कोशिकाओं
एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के encapsulation द्वारा बैक्टीरियल ग्लूटामेट रिसेप्टर चैनल का पुनर्गठन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, … More

Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System. J. Vis. Exp. (205), e66595, doi:10.3791/66595 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter