Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekonstituering av den bakterielle glutamatreseptorkanalen ved innkapsling av et cellefritt ekspresjonssystem

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66595
Automatic Translation
*1,2, *3, 2,3,4,5
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver den inverterte emulsjonsmetoden som brukes til å innkapsle et cellefritt ekspresjonssystem (CFE) i en gigantisk unilamellær vesikkel (GUV) for undersøkelse av syntese og inkorporering av et modellmembranprotein i lipid-dobbeltlaget.

Abstract

Cellefrie ekspresjonssystemer (CFE) er kraftige verktøy innen syntetisk biologi som tillater biomimikk av cellulære funksjoner som biosensing og energiregenerering i syntetiske celler. Rekonstruksjon av et bredt spekter av cellulære prosesser krever imidlertid vellykket rekonstituering av membranproteiner i membranen til syntetiske celler. Mens ekspresjonen av løselige proteiner vanligvis er vellykket i vanlige CFE-systemer, har rekonstituering av membranproteiner i lipid-dobbeltlag av syntetiske celler vist seg å være utfordrende. Her demonstreres en metode for rekonstituering av et modellmembranprotein, bakteriell glutamatreseptor (GluR0), i gigantiske unilamellære vesikler (GUV) som modellsyntetiske celler basert på innkapsling og inkubasjon av CFE-reaksjonen inne i syntetiske celler. Ved å bruke denne plattformen demonstreres effekten av å substituere det N-terminale signalpeptidet til GluR0 med proteorhodopsin-signalpeptid på vellykket kotranslasjonell translokasjon av GluR0 til membraner av hybride GUV-er. Denne metoden gir en robust prosedyre som vil tillate cellefri rekonstituering av ulike membranproteiner i syntetiske celler.

Introduction

Nedenfra og opp syntetisk biologi har fått økende interesse det siste tiåret som et fremvoksende felt med mange potensielle anvendelser innen bioteknologi, legemiddellevering og regenerativ medisin 1,2. Utviklingen av syntetiske celler som en hjørnestein i syntetisk biologi nedenfra og opp, har spesielt tiltrukket seg et bredt spekter av vitenskapelige miljøer på grunn av de lovende anvendelsene av syntetiske celler, så vel som deres cellelignende fysiske og biokjemiske egenskaper som letter in vitro biofysiske studier 3,4,5,6 . Syntetiske celler er ofte konstruert i cellestore gigantiske unilamellære vesikler (GUV) der forskjellige biologiske prosesser gjenskapes. Rekonstituering av cellecytoskjelett 7,8, lysavhengig energiregenerering9, cellulær kommunikasjon10,11 og biosensing12 er eksempler på innsats som er gjort for å rekonstruere cellelignende atferd i syntetiske celler.

Mens noen cellulære prosesser er avhengige av løselige proteiner, bruker mange egenskaper ved naturlige celler, som sensing og kommunikasjon, ofte membranproteiner, inkludert ionekanaler, reseptorer og transportører. En stor utfordring i syntetisk celleutvikling er rekonstituering av membranproteiner. Selv om tradisjonelle metoder for membranproteinrekonstituering i lipid-dobbeltlag er avhengige av vaskemiddelmediert rensing, er slike metoder arbeidskrevende, ineffektive for proteiner som er giftige for ekspresjonsverten, eller er ofte ikke egnet for membranproteinrekonstituering i GUV-er13.

En alternativ metode for proteinekspresjon er cellefrie ekspresjonssystemer (CFE). CFE-systemer har vært et kraftig verktøy innen syntetisk biologi som tillater in vitro-ekspresjon av ulike proteiner ved bruk av enten cellelysat eller renset transkripsjonstranslasjonsmaskineri14. CFE-systemer kan også innkapsles i GUV-er, og dermed tillate oppdelte proteinsyntesereaksjoner som kan programmeres for ulike applikasjoner, for eksempel å lage lyshøstende syntetiske celler9 eller mekanosensitive biosensorer15,16. Analogt med rekombinante proteinekspresjonsmetoder er membranproteinekspresjon utfordrende i CFE-systemer17. Aggregering, feilfolding og mangel på post-translasjonell modifikasjon i CFE-systemer er store flaskehalser som hindrer vellykket membranproteinsyntese ved bruk av CFE-systemer. Vanskeligheten med rekonstituering av membranprotein nedenfra og opp ved bruk av CFE-systemer skyldes delvis fraværet av en kompleks membranproteinbiogenesevei som er avhengig av signalpeptider, signalgjenkjenningspartikler, translokanser og chaperoning-molekyler. Imidlertid har nylig flere studier antydet at tilstedeværelsen av membranøse strukturer som mikrosomer eller liposomer under translasjon fremmer vellykket membranproteinuttrykk 18,19,20,21. I tillegg Eaglesfield et al. og Steinküher et al. har funnet ut at inkluderingen av spesifikke hydrofobe domener kjent som signalpeptider i N-terminalen til membranproteinet kan forbedre uttrykket betydelig22,23. Til sammen antyder disse studiene at utfordringen med membranproteinrekonstituering i syntetiske celler kan overvinnes hvis proteintranslasjonen skjer i nærvær av GUV-membranen og hvis riktig N-terminalt signalpeptid brukes.

Her presenteres en protokoll for innkapsling av proteinsyntesen ved bruk av rekombinante elementer (PURE) CFE-reaksjoner for membranproteinrekonstituering i GUV-er. Bakteriell glutamatreseptor24 (GluR0) er valgt som modellmembranprotein, og effekten av dets N-terminale signalpeptid på membranrekonstituering studeres. Effekten av proteorhodopsin-signalpeptid, som ble vist å forbedre membranproteinrekonstitusjonseffektiviteten av Eaglesfield et al.22, undersøkes ved å konstruere en mutert variant av GluR0 betegnet som PRSP-GluR0 og dens ekspresjon og membranlokalisering med villtype GluR0 (heretter referert til som WT-GluR0) som inneholder sitt opprinnelige signalpeptid. Denne protokollen er basert på den inverterte emulsjonsmetoden25 med modifikasjoner som gjør den robust for CFE-innkapsling. I den presenterte metoden emulgeres CFE-reaksjonene først ved hjelp av en lipid-i-olje-løsning som genererer dråper på mikronstørrelse som inneholder CFE-systemet og stabiliseres av lipidmonolaget. Emulsjonsdråpene legges deretter på toppen av et olje-vann-grensesnitt som er mettet med et annet lipidmonolag. Emulsjonsdråpene blir deretter tvunget til å bevege seg over olje-vann-grensesnittet via sentrifugalkraft. Gjennom denne prosessen får dråpene et annet monolag, og genererer dermed en tolags lipidvesikkel. GUV-ene som inneholder CFE-reaksjonen blir deretter inkubert, hvor membranproteinet uttrykkes og inkorporeres i GUV-membranen. Selv om denne protokollen er spesifisert for cellefri ekspresjon av GluR0, kan den brukes til cellefri syntese av andre membranproteiner eller forskjellige syntetiske celleapplikasjoner som cytoskjelettrekonstituering eller membranfusjonsstudier26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Reagensene og utstyret som brukes til denne studien er gitt i materialtabellen.

1. Bulk CFE-reaksjoner i nærvær av små unilamellære vesikler (SUV-er)

  1. Forberedelse av SUV
    NOTAT: Dette trinnet må utføres i et avtrekkshette i henhold til sikkerhetsinstruksjonene for arbeid med kloroform.
    1. Forbered 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfokolin (POPC) SUV-er i et hetteglass ved å overføre 76 μL 25 mg/ml POPC-stamløsning oppløst i kloroform.
    2. Mens du roterer hetteglasset forsiktig, blåser du en mild strøm av argon inn i hetteglasset for å danne en film av tørkede lipider i bunnen. Deretter overfører du hetteglasset til en ekssikkator med hetten løst skrudd for å fordampe overflødig kloroform.
    3. Oppbevar hetteglasset i ekssikkatoren i 1 time. Tilsett deretter 0,5 ml ultrarent avionisert vann for å løse opp lipidfilmen og virvelen i ca. 2 minutter.
    4. Sett opp et mini-ekstruderingsapparat ved å bløtlegge to filterstøtter i avionisert vann og plassere dem på hver av de indre membranstøttene. Bløtlegg deretter et 100 nm polykarbonatfilter og plasser det mellom de to indre membranstøttene som holdes sammen av ekstruderens ytre foringsrør og holdemutteren. Plasser dette oppsettet i ekstruderstativet.
    5. Skyll to 1 ml gasstette sprøyter 3 ganger med ultrarent avionisert vann.
    6. Legg sample av lipid-vannblanding i en av de 1 ml gasstette sprøytene og plasser den i den ene enden av miniekstruderen ved å bruke svingarmklemmene for å holde sprøyten på plass. Sett den andre sprøyten inn i den andre enden av miniekstruderen og sørg for at den er helt trykket ned.
      NOTAT: Når du legger sprøyten med lipid-vannblandingen, sørg for at det ikke er luft i sprøyten før du fører den gjennom mini-ekstruderen.
    7. Før lipid-vannblandingen forsiktig fra den originale sprøyten til den tomme sprøyten gjennom mini-ekstruderapparatet. Gjenta dette trinnet 11 ganger for å danne SUV-er. Overfør SUV-ene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      MERK: SUV-løsningen kan lagres ved 4 °C i opptil 2 uker.
  2. CFE-reaksjonsenhet
    1. Sett sammen CFE-reaksjonen ved å følge den cellefrie ekspresjonsprotokollen levert av produsenten med små modifikasjoner beskrevet i det følgende.
    2. Bland 10 μL løsning 1 (som inneholder aminosyrer, NTP-er, tRNA-er og substrater for enzymer, og nødvendig buffer), 1 μL løsning 2 (proteiner i 20 % glyserol), 2 μL løsning 3 (ribosom (20 μM)), passende mengde DNA som koder for løselig sfGFP-sfCherry(1-10)27 (heretter referert til som løselig sfGFP), WT-GluR0-sfGFP eller PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 basepar), 1 μL murin RNAse-hemmer, og 4 μL 5 mM SUV-løsning for membranproteiner eller 4 μL vann for løselige proteiner.
    3. Ta reaksjonens endelige volum til 20 μL ved å tilsette ultrarent avionisert vann.
      NOTAT: Ved montering av CFE-systemet må alle komponenter holdes på is. Alle materialer er temperaturfølsomme og kan brytes ned hvis de når romtemperatur.
  3. CFE-reaksjonsinkubasjon og overvåking
    1. Overfør CFE-løsningen til en 96-brønns konisk V-bunnplate. For å forhindre fordampning i løpet av reaksjonen, dekk platen med en tetningsfilm.
    2. Inkuber platen ved 37 °C i en plateleser i 4-5 timer mens du overvåker CFE-reaksjonen ved å måle GFP-signalet med en forsterkning på 100 ved 488 nm/528 nm eksitasjons-/emisjonsbølgelengder hvert 2.

2. CFE-reaksjoner innkapslet i GUV-er

  1. Fremstilling av GUV ytre bufferløsning
    1. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, bland 1,5 μL 1 M spermidin, 37,5 μL 100 mM ATP, 25 μL 100 mM GTP, 12,5 μL 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M kreatinfosfat, 18 μL 1 M magnesiumacetat, 93,33 μL 3 M kaliumglutamat, 50 μL 1 M HEPES KOH (pH 7.4), 1.15 μL 332 mM folinsyre, 100 μL 2 M glukose og 50 μL fra stamløsning av 6 mM blanding av hver av de 20 aminosyrene (fremstilt ved å følge protokollen beskrevet av Sun et al.28).
    2. Bring løsningens endelige volum til 1 ml ved å tilsette ultrarenset avionisert vann.
      NOTAT: Alle komponenter må oppbevares på is. Tilsett aminosyreblandingen på slutten for å unngå aminosyreutarming28. Løsningen kan alikvoteres i 330 μL alikvoter og lagres ved -20 °C frem til bruk.
  2. Fremstilling av lipid-i-olje-blandingen
    MERK: dette trinnet må utføres i et avtrekkshette i henhold til sikkerhetsinstruksjonene for arbeid med kloroform.
    1. I et avtrekksskap blandes 17,3 μL 25 mg/ml POPC-stamløsning og 1,08 μL 50 mg/ml poly(butadien)-b-poly(etylenoksid) (PEO-b-PBD) kopolymer i et 15 ml hetteglass.
      NOTAT: Den endelige lipid-i-olje-løsningen inneholder 0,5 mM lipid med henholdsvis 95 % og 5 % POPC og PEO-b-PBD. PEO-b-PBD ble brukt til å forbedre membranstabiliteten under proteinekspresjon, men ble holdt i et lavt molart forhold for å redusere kopolymerens tendens til å aggregere til miceller atskilt fra lipidmolekyler29,30.
    2. Blås forsiktig en mild strøm av argongass inn i glassglasset mens du roterer hetteglasset for å fordampe kloroformen.
    3. Pipetter 1,2 ml lett mineralolje inn i 15 ml hetteglasset som inneholder de tørkede lipidene.
    4. Bland lipidene og oljen ved å virvle på maksimal hastighet i 10-20 s. Den oppløste lipid-kopolymerblandingen vil se uklar ut.
    5. For å sikre at alle mulige lipidaggregater i oljen er fullstendig oppløst og spredt gjennom oljen, plasser hetteglasset i en ovn ved rundt 50 °C i 20 minutter før du virvler i ytterligere 10-20 s ved maksimal hastighet.
  3. CFE-reaksjonsmontering og innkapsling (figur 1 oppsummerer følgende trinn).
    1. Forbered 300 μL av den ytre GUV-løsningen i et 1.5 ml mikrosentrifugerør ved å blande 270 μL CFE ytre bufferløsning tilberedt i trinn 2.1, 15 μL 5 M NaCl og 15 μL 4.5 M KCl.
      NOTAT: På dette trinnet, tilsett 0.45 μL 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT) til den ytre GUV-løsningen. Hensikten med å tilsette NaCl og KCl er å justere den ytre løsningens osmolalitet for å matche den med den indre CFE-løsningen. Det nøyaktige volumet av NaCl og KCl avhenger av ønsket osmolalitetsjustering. Man kan legge til enten NaCl eller KCl eller begge deler for å justere osmolaliteten.
    2. Pipetter forsiktig 300 μL lipid-i-olje-blanding på toppen av den ytre GUV-løsningen.
      MERK: Når du tilsetter lipid-oljeblandingen, er det viktig at oljen ikke blandes med den vandige ytre løsningen. Etter tilsetningen skal det være et synlig grensesnitt mellom lipid-i-olje-blandingen og den ytre GUV-løsningen.
    3. Inkuber olje-vann-grensesnittet ved romtemperatur i 2 timer for å la lipidmonolaget dannes og stabilisere seg ved grensesnittet.
    4. I mellomtiden, følg avsnitt 1.2.1 for å sette sammen en CFE-reaksjon som inneholder plasmid-DNA som koder for membranproteinvariantene eller løselig GFP. Bytt ut 4 μL 5 mM SUV-løsning eller vann med 4 μL 1 M sukrose. Denne reaksjonen vil være den indre GUV-løsningen.
      MERK: Et osmometer ble brukt til å måle osmolaliteten til de indre og ytre løsningene. Osmolaliteten til den ytre løsningen ble deretter justert tilsvarende ved tilsetning av NaCl eller vann. Osmolaliteten til CFE-reaksjonen er vanligvis rundt 1600 mOsm/Kg. Tilsetning av sukrose til reaksjonen øker den indre løsningstettheten, og lar dermed vesiklene bevege seg over olje-vann-grensesnittet under sentrifugeringstrinnet. Et alternativ til sukrose er Opti-Prep tetthetsgradientløsning.
    5. Tilsett 600 μL lipid-oljeblanding til mikrosentrifugerøret som inneholder CFE-reaksjonen og pipetter kraftig opp og ned i ~ 1 minutt for å emulgere reaksjonen i lipid-i-olje-løsning og danne lipidmonolaget rundt syntetiske celler.
      NOTAT: Den endelige løsningen skal ikke ha noen bobler og skal se ugjennomsiktig ut.
    6. Pipetterer forsiktig den indre løsningsemulsjonen på toppen av oljelaget i 1,5 ml mikrosentrifugerøret der olje-vann-grensesnittet ble satt opp.
      NOTAT: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer eller destabiliserer grensesnittet.
    7. Sentrifuger i 10 minutter ved 2 000 x g ved 4 °C.
      NOTAT: Sentrifugeringshastigheten ble optimalisert for denne protokollen. Adir et al.31 rapporterte en annen sentrifugehastighet.
    8. Når sentrifugeringen er over, fjern forsiktig overflødig olje og ytre løsning fra mikrosentrifugerøret ved hjelp av en pipettor. Fjern den ytre løsningen til det gjenværende volumet er rundt 100 μL.
      NOTAT: En pellet med GUV-er er vanligvis synlig i bunnen av mikrosentrifugerøret. men, mangel på en synlig pellet betyr ikke nødvendigvis at det ikke er noe GUV-utbytte. I stedet for å bruke en pipettor, kan overflødig olje på toppen av den ytre løsningen fjernes ved aspirasjon. Det er avgjørende å sikre at lipid-i-olje-løsningen er fullstendig fjernet. Oljeforurensning i GUV-løsning kan forårsake bilder av lav kvalitet.
    9. Resuspender GUV-pelleten i den gjenværende 100 μL løsningen ved å pipettere forsiktig opp og ned. Deretter overfører du GUV-løsningen til en ren 96 brønn klar flat bunnplate for å inkubere.

3. Innkapslet CFE-reaksjonsinkubasjon og avbildning

  1. Dekk platen med en tetningsfilm for å forhindre fordampning. Inkuber platen ved 37 °C i 5-6 timer. Man kan bruke en plateleser og følge trinn 1.3.2 for å klargjøre plateleseren for inkubasjonstrinnet.
  2. Når inkubasjonen er over, plasser 96-brønnsplaten på bildetrinnet til et omvendt mikroskop utstyrt med et EMCCD-kamera (eller et sCMOS-kamera), DAQ-MX-kontrollert laser (eller et integrert laserkombinatorsystem) og en CSU-X1 spinnende disk konfokal (eller en laserskanningskonfokal). Fokuser på avkastning som inneholder GUV-er og ta bilder med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm ved hjelp av et Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA-objektiv.
  3. Lagre bilder av GUV-er i .tiff format.
  4. Åpne bildene i et bildebehandlingsprogram (f.eks. Åpne innstillingspanelet for lysstyrke/kontrast . Juster lysstyrken og kontrasten til passende innstillinger som gjør fluorescerende proteiner synlige.
  5. Hvis målet er å sammenligne signalintensiteten til forskjellige uttrykte proteiner, må du først stable individuelle bilder av GUV-er som inneholder forskjellige proteiner ved å bruke Bilder som skal stables-panelet under undermenyen Bilde > stabler . Deretter justerer du lysstyrken og kontrasten til alle bildene ved hjelp av Lysstyrke/kontrast-panelet .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før innkapsling av CFE-reaksjonene ble to varianter av GluR0-sfGFP med native og proteorhodopsin-signalpeptider (signalpeptidsekvenser er presentert i tilleggstabell 1), og den løselige sfGFP ble individuelt uttrykt i bulkreaksjoner, og deres uttrykk ble overvåket ved å detektere sfGFP-signalet ved hjelp av en plateleser (figur 2A). Membranproteiner ble uttrykt i fravær eller tilstedeværelse av 100 nm SUV-er. I tillegg, ved å bruke en kalibreringskurve som korrelerer sfGFP-signalet til konsentrasjonen (tilleggsfigur 1), ble konsentrasjoner av syntetiserte proteiner estimert (tilleggstabell 2). Det er klart at løselig sfGFP hadde det høyeste uttrykket blant alle tre proteinene, noe som antyder at ekspresjonen av membranproteiner pålegger CFE-systemet en belastning, og dermed bremser reaksjonen og senker utbyttet. I tillegg viste reaksjoner som uttrykker membranproteiner i nærvær av SUV-er i gjennomsnitt høyere sfGFP-signal sammenlignet med reaksjoner som mangler SUV-er. Denne observasjonen stemmer overens med funnene til Steinküher et al., som viste at ekspresjonen av membranproteiner reduserer kapasiteten til CFE-systemene til å produsere proteiner23. Likevel, gitt den vellykkede demonstrasjonen av proteinuttrykk i bulk CFE-reaksjon, kan man resonnere at innkapslet CFE også vil syntetisere proteiner inne i GUV-er.

Deretter ble individuelle CFE-reaksjoner innkapslet i GUV-er ved å bruke den inverterte emulsjonsmetoden for å uttrykke varianter av GluR0, nemlig WT-GluR0, PRSP-GluR0 og løselig sfGFP. Mens WT-GluR0, som inneholder GluR0 native signalpeptid, viste utmerket ekspresjon og membranlokalisering (figur 2B, venstre panel), viste ikke motparten, PRSP-GluR0, som har proteorhodopsin N-terminalt signalpeptid, lignende sterk membranlokalisering. PRSP-GluR0 ble funnet å være mer utsatt for aggregering og punktdannelse (figur 2B, midtpanel). Som forventet ble løselig sfGFP uttrykt i GUV-er og holdt seg i GUV-lumen (figur 2B, høyre panel; se tilleggsfigur 2 for bilder av kohorter av GUV-er).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelle trinn for invertert emulsjon. (1) Trinn 2.3.1 til trinn 2.3.3 i protokollen er visualisert for å demonstrere monteringen av lipidmonolaget ved grensesnittet mellom lipid-oljeblandingen og den ytre bufferløsningen. (2) Visualisering av trinn 2.3.5 i protokollen er vist her for å representere dannelsen av lipidmonolaget rundt emulgerte dråper som innkapsler den indre CFE-løsningen. (3) Trinn 2.3.6 i protokollen viser tilsetning av monolags GUV-er til mikrosentrifugerøret med lipidmonolaget i grensesnittet mellom en lipid-oljeblanding og ytre bufferløsning. (4) Trinn 2.3.7 er avbildet her, der sentrifugering fører til dannelsen av en GUV-pellet i den ytre løsningen. (5) Trinn 2.3.8 er vist her, som indikerer prosessen med å fjerne overflødig lipid-i-olje-blanding og ytre løsning. (6) Til slutt er trinn 2.3.9 avbildet her, hvor GUV-pelleten resuspenderes i den ytre løsningen, og GUV-ene er klare for inkubasjon, etterfulgt av avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Proteinekspresjon i bulk CFE-reaksjoner og i GUV-er som innkapsler CFE-reaksjoner. (A) Fluorescensavlesninger av individuelle bulk CFE-reaksjoner som uttrykker WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP og løselig sfGFP. Den oppløselige sfGFP-grafen representerer signalet fra en 2,5 μL-reaksjon (standard reaksjonsvolum er 20 μL) for å unngå overmetning av platelesermålingene. Data presenteres som gjennomsnitt ± S.D, n = 3. (B) Venstre: Et representativt konfokalt bilde av en GUV-innkapsling CFE-reaksjon som uttrykker WT-GluR0-sfGFP. Midten: Et representativt konfokalt bilde av GUV-er som innkapsler CFE-reaksjon som uttrykker PRSP-GluR0-sfGFP. Til høyre: Et representativt konfokalt bilde av en GUV-innkapsling CFE-reaksjon som uttrykker løselig sfGFP. Målestokker: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Kalibreringskurven for sfGFP-signalet og den tilhørende lineære regresjonsanalysen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Representativt konfokalt bilde av kohorter av GUV-er som uttrykker (venstre) WT-GluR0-sfGFP, (midten) PRSP-GluR0-sfGFP og (høyre) løselig sfGFP. Skalalinje: 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 1: Aminosyresekvensen til villtype- og proteorhodopsin-signalpeptider. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: Konsentrasjonen av syntetiserte proteiner i bulk CFE-reaksjoner. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Praktisk talt enhver cellulær prosess som er avhengig av overføring av molekyler eller informasjon over cellemembranen, som cellesignalering eller celleeksitasjon, krever membranproteiner. Dermed har rekonstituering av membranproteiner blitt den viktigste flaskehalsen for å realisere ulike syntetiske celledesign for forskjellige bruksområder. Tradisjonell vaskemiddelmediert rekonstituering av membranproteiner i biologiske membraner krever GUV-genereringsmetoder som skånsom hevelse eller elektroformasjon. Hevelsestilnærminger produserer vanligvis små vesikler, og elektroformasjonsutbyttet synker betydelig når kompliserte løsninger, som ofte er tilfelle ved generering av syntetiske celler, er innkapslet32. I tillegg løser vaskemidler membranproteinet, og fjerning av dem under rekonstitueringsprosessen kan føre til feilfoldingav protein 33,34. På den annen side er tilnærmingen som presenteres her avhengig av kotranslasjonell inkorporering av membranproteinet i lipid-dobbeltlaget, som ligner mer på den naturlige proteinbiogeneseveien i celler22.

Fra et teknisk synspunkt er den presenterte protokollen fordelaktig for andre vanlige innkapslingsmetoder, for eksempel elektroformasjon og kontinuerlig dråpegrensesnittkryssinginnkapsling 7,8,35,36 (cDICE), for enklere implementering ettersom det eneste laboratorieutstyret som kreves for GUV-generering er en sentrifuge. I motsetning til elektroformasjon, tillater den inverterte emulsjonsmetoden innkapsling av forskjellige kombinasjoner av molekyler med forskjellige konsentrasjoner. I tillegg, sammenlignet med den originale inverterte emulsjonsteknikken25, genererer denne tilnærmingen mer stabile GUV-er som er egnet for innkapsling av CFE-lysater eller PURE-systemer. Den høyere GUV-stabiliteten skyldes tilstedeværelsen av diblokkkopolymer i sammensetningen av GUV-membran37, samt den lange inkubasjonen av olje-vann-grensesnittet som gjør at grensesnittet kan mettes med lipidmolekyler. Til slutt, i motsetning til mikrofluidikktilnærminger, krever ikke protokollen som presenteres her små kanaler og slanger. Derfor kan CFE-reaksjonen innkapsles så snart den er montert, og den kortere tiden for GUV-montering på grunn av mangel på flyt og mulig tilstopping forhindrer for tidlig start av CFE-reaksjonen. Mens demonstrasjonen av membranproteinekspresjon i denne protokollen er eksklusiv for PUREfrix-reaksjoner, kan man utvide denne metoden til å syntetisere proteiner ved å bruke forskjellige tilgjengelige CFE-systemer, for eksempel lysatbaserte bakterielle eller pattedyrs CFE-systemer.

Den presenterte tilnærmingen her har begrensninger som er forårsaket av den oljeavhengige naturen til GUV-dannelsesprosessen og intensjonen om å ha stabile GUV-er. Denne tilnærmingen er vanligvis lengre sammenlignet med andre metoder, for eksempel cDICE eller mikrofluidikk, på grunn av den lange inkubasjonstiden til olje-vann-grensesnittet som kreves for grensesnittstabilisering og høyt GUV-utbytte. I tillegg er lipidsammensetningen først og fremst begrenset til POPC med små doser av andre lipider eller blokkkopolymerer, mens andre metoder, som elektrodannelse, er mer egnet for inkorporering av lipider med forskjellige fysiske og kjemiske egenskaper. Mens GUV-membransammensetningen i denne metoden er en blanding av POPC og PBD-PEO for å maksimere CFE-utbyttet, kan mulige variasjoner i GUV-membransammensetning testes. Imidlertid kan ytterligere optimalisering av parametrene være nødvendig for andre membranproteiner. Siden dråpeemulgeringen skjer gjennom manuell pipettering, er GUV-ene som genereres via denne metoden polydisperse og ganske heterogene i størrelse. Videre kan det faktum at lipider er oppløst i den organiske fasen av og til forårsake et lag med olje mellom de to brosjyrene i GUV-membranen eller forurense bildekammeret med olje som kan være skadelig for bildekvaliteten. En mulig løsning for utfordringen med restolje er å erstatte mineralolje med et flyktig organisk løsningsmiddel, for eksempel dietyleter, som vist av Tsumoto et al.38, for å stole på løsemiddelfordampning sammen med sentrifugering under GUV-dannelse.

Selv om det ikke er noen demonstrasjon av kanalfunksjon i dette arbeidet, inspirert av tidligere analyser brukt for å undersøke rekonstituert mekano- eller lysfølsom kanalfunksjonalitet, er en fluorescensmikroskopibasert analyse skissert. Åpningen av GluR0-kanalen er rapportert å øke membranledningsevnen for K+- ioner24. Fordi CFE-reaksjoner allerede inneholder en høy konsentrasjon av K+, vil typiske kaliumindikatorer ikke være egnet for å vurdere kanalfunksjonalitet. Men fordi kaliumtilstrømning endrer membranpotensialet, kan sensitive membranpotensialindikatorer som DiBAC4(3)22 eller BeRST 139 rapportere GluR0-aktivitet i nærvær av glutamat.

Vellykket rekonstituering av membranproteiner i syntetiske celler åpner for mange muligheter for å lage syntetiske celler med enestående evner som mer etterligner naturlige celler. En nåværende stor ulempe med syntetiske celler er deres manglende evne til å reprodusere og resirkulere energi. Men med lys- og kjemikalieavhengige energiregenereringsordninger som er sterkt avhengige av membranproteiner, kan man se for seg langvarige syntetiske celler40. Bruk av CFE-systemer tillater rekonstituering av flere membranproteiner som samlet kan utføre visse oppgaver. For eksempel kan rekonstituering av en ligandstyrt ionekanal som ligner på GluR0 beskrevet her, sammen med forskjellige spenningsstyrte ionekanaler, føre til konstruksjon av en eksiterbar nevronlignende syntetisk celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

APL anerkjenner støtte fra National Science Foundation (EF1935265), National Institutes of Health (R01-EB030031 og R21-AR080363) og Army Research Office (80523-BB)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 nm polycarbonate filter STERLITECH 1270193
96 Well Clear Bottom Plate ThermoFisher Scientific 165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader Agilent 11-120-533
Creatine phosphate Millipore Sigma 10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit Yokogawa CSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep) Millipore Sigma D1556 Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports Avanti 610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrate Millipore Sigma F7878
Glucose Millipore Sigma 158968
HEPES Millipore Sigma H3375
iXon X3 camera  Andor DU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1501
Light mineral oil Millipore Sigma M5904
Magnesium acetate tetrahydrate  Millipore Sigma M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) Avanti 610020
Olympus IX81 Inverted Microscope  Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective  Olympus 1-U2B933 
PEO-b-PBD Polymer Source P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
POPC lipid in chloroform  Avanti 850457C
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
PUREfrex 2.0 Cosmo Bio USA GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set New England BioLabs N0450
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs M0314S
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride Millipore Sigma S9888
Spermidine Millipore Sigma S2626
Sucrose Millipore Sigma S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 ELITechGroup VAPRO 5600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

Tags

Nøkkelord: Cellefri ekspresjon membranproteinrekonstitusjon glutamatreseptor gigantiske unilamellære vesikler proteorhodopsin-signalpeptid syntetiske celler
Rekonstituering av den bakterielle glutamatreseptorkanalen ved innkapsling av et cellefritt ekspresjonssystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, … More

Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System. J. Vis. Exp. (205), e66595, doi:10.3791/66595 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter