Summary
Detta protokoll beskriver den inverterade emulsionsmetoden som används för att kapsla in ett CFE-system (cell-free expression) i en gigantisk unilamellär vesikel (GUV) för undersökning av syntesen och inkorporeringen av ett modellmembranprotein i lipiddubbelskiktet.
Abstract
CFE-system (Cell-Free Expression) är kraftfulla verktyg inom syntetisk biologi som möjliggör biomimik av cellulära funktioner som bioavkänning och energiregenerering i syntetiska celler. Rekonstruktion av ett brett spektrum av cellulära processer kräver dock framgångsrik rekonstitution av membranproteiner i membranet hos syntetiska celler. Medan uttrycket av lösliga proteiner vanligtvis är framgångsrikt i vanliga CFE-system, har rekonstitueringen av membranproteiner i lipidlager av syntetiska celler visat sig vara utmanande. Här demonstreras en metod för rekonstituering av ett modellmembranprotein, bakteriell glutamatreceptor (GluR0), i gigantiska unilamellära vesiklar (GUVs) som modellsyntetiska celler baserat på inkapsling och inkubation av CFE-reaktionen inuti syntetiska celler. Med hjälp av denna plattform demonstreras effekten av att ersätta den N-terminala signalpeptiden av GluR0 med proteorhodopsinsignalpeptid på framgångsrik cotranslationell translokation av GluR0 till membran av hybrid-GUVs. Denna metod ger en robust procedur som möjliggör cellfri rekonstitution av olika membranproteiner i syntetiska celler.
Introduction
Syntetisk biologi nedifrån och upp har fått ett ökat intresse under det senaste decenniet som ett framväxande område med många potentiella tillämpningar inom bioteknik, läkemedelstillförsel och regenerativ medicin 1,2. Utvecklingen av syntetiska celler som en hörnsten i syntetisk biologi nedifrån och upp, i synnerhet, har lockat ett brett spektrum av vetenskapliga samfund på grund av de lovande tillämpningarna av syntetiska celler samt deras cellliknande fysikaliska och biokemiska egenskaper som underlättar biofysiska studier in vitro 3,4,5,6 . Syntetiska celler är ofta konstruerade i cellstora jättelika unilamellära vesiklar (GUV) där olika biologiska processer återskapas. Rekonstitution av cellens cytoskelett 7,8, ljusberoende energiregenerering9, cellulär kommunikation10,11 och bioavkänning12 är exempel på försök som gjorts för att rekonstruera cellliknande beteenden i syntetiska celler.
Medan vissa cellulära processer är beroende av lösliga proteiner, använder många egenskaper hos naturliga celler, såsom avkänning och kommunikation, ofta membranproteiner, inklusive jonkanaler, receptorer och transportörer. En stor utmaning vid syntetisk cellutveckling är rekonstitueringen av membranproteiner. Även om traditionella metoder för rekonstituering av membranprotein i lipidlager är beroende av tvättmedelsmedierad rening, är sådana metoder mödosamma, ineffektiva för proteiner som är giftiga för uttrycksvärden, eller är ofta inte lämpliga för rekonstitution av membranprotein i GUVs13.
En alternativ metod för proteinuttryck är cellfria uttryckssystem (CFE). CFE-system har varit ett kraftfullt verktyg inom syntetisk biologi som möjliggör in vitro-uttryck av olika proteiner med hjälp av antingen celllysat eller renat transkriptions-translationsmaskineri. CFE-system kan också kapslas in i GUV:er, vilket möjliggör uppdelade proteinsyntesreaktioner som kan programmeras för olika tillämpningar, såsom skapandet av ljusskördande syntetiska celler9 eller mekanokänsliga biosensorer15,16. Analogt med metoder för rekombinant proteinuttryck är membranproteinuttryck utmanande i CFE-system17. Aggregering, felveckning och brist på posttranslationell modifiering i CFE-system är stora flaskhalsar som hindrar framgångsrik membranproteinsyntes med hjälp av CFE-system. Svårigheten med rekonstitution av membranprotein nedifrån och upp med CFE-system beror delvis på frånvaron av en komplex biogenesväg för membranprotein som förlitar sig på signalpeptider, signaligenkänningspartiklar, translokoner och chaperoningmolekyler. På senare tid har dock flera studier föreslagit att närvaron av membranösa strukturer såsom mikrosomer eller liposomer under translationen främjar ett framgångsrikt membranproteinuttryck 18,19,20,21. Dessutom har Eaglesfield et al. och Steinküher et al. funnit att inkluderingen av specifika hydrofoba domäner som kallas signalpeptider i N-terminalen av membranproteinet kan förbättra dess uttryckavsevärt 22,23. Sammantaget tyder dessa studier på att utmaningen med rekonstitution av membranprotein i syntetiska celler kan övervinnas om proteintranslationen sker i närvaro av GUV-membranet och om korrekt N-terminal signalpeptid används.
Här presenteras ett protokoll för inkapsling av proteinsyntesen med hjälp av rekombinanta element (PURE) CFE-reaktioner för rekonstituering av membranprotein i GUVs. Bakteriell glutamatreceptor24 (GluR0) väljs som modellmembranprotein, och effekten av dess N-terminala signalpeptid på dess membranrekonstitution studeras. Effekten av proteorhodopsinsignalpeptid, som har visat sig förbättra effektiviteten av rekonstitution av membranprotein av Eaglesfield et al.22, undersöks genom att konstruera en muterad variant av GluR0 betecknad som PRSP-GluR0 och dess uttryck och membranlokalisering med vildtyp GluR0 (hädanefter kallad WT-GluR0) som hyser dess naturliga signalpeptid jämförs. Detta protokoll är baserat på den inverterade emulsionsmetoden25 med modifieringar som gör det robust för CFE-inkapsling. I den presenterade metoden emulgeras CFE-reaktionerna först med hjälp av en lipid-i-olja-lösning som genererar mikronstora droppar som innehåller CFE-systemet och stabiliseras av lipidmonolagret. Emulsionsdropparna läggs sedan ovanpå ett olje-vattengränssnitt som är mättat med ett annat lipidmonolager. Emulsionsdropparna tvingas sedan att färdas över gränsytan mellan olja och vatten med hjälp av centrifugalkraften. Genom denna process får dropparna ytterligare ett monolager, vilket genererar en lipidvesikel i två lager. De GUV:er som innehåller CFE-reaktionen inkuberas sedan, under vilka membranproteinet uttrycks och inkorporeras i GUV-membranet. Även om detta protokoll är specificerat för cellfritt uttryck av GluR0, kan det användas för cellfri syntes av andra membranproteiner eller olika syntetiska cellapplikationer såsom cytoskelettrekonstitution eller membranfusionsstudier26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De reagenser och utrustning som används för denna studie finns i materialtabellen.
1. Bulk CFE-reaktioner i närvaro av små unilamellära vesiklar (SUV)
- Förberedelse för SUV
OBS: Detta steg måste utföras i ett dragskåp enligt säkerhetsinstruktionerna för arbete med kloroform.- Bered 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC) SUV i en injektionsflaska av glas genom att överföra 76 μl 25 mg/ml POPC-stamlösning upplöst i kloroform.
- Medan du försiktigt roterar injektionsflaskan av glas, blås en mild stråle av argon in i injektionsflaskan för att bilda en film av torkade lipider i botten. Överför sedan glasflaskan till en exsickator med locket löst skruvat för att avdunsta överflödig kloroform.
- Förvara injektionsflaskan av glas i exsickatorn i 1 timme. Tillsätt sedan 0,5 ml ultrarent avjoniserat vatten för att lösa upp lipidfilmen och virveln i cirka 2 minuter.
- Ställ in en mini-extruderingsapparat genom att blötlägga två filterstöd i avjoniserat vatten och placera dem på vart och ett av de inre membranstöden. Blötlägg sedan ett 100 nm polykarbonatfilter och placera det mellan de två inre membranstöden som hålls ihop av extruderns ytterhölje och hållarmuttern. Placera denna inställning i extruderstativet.
- Spola två 1 ml gastäta sprutor 3 gånger med ultrarent avjoniserat vatten.
- Ladda provet av lipid-vattenblandning i en av de 1 ml gastäta sprutorna och placera den i ena änden av miniextrudern med hjälp av svängarmsklämmorna för att hålla sprutan på plats. Sätt in den andra sprutan i den andra änden av miniextrudern och se till att den är helt intryckt.
OBS: När du laddar sprutan med lipid-vattenblandningen, se till att det inte finns någon luft i sprutan innan du för den genom miniextrudern. - För försiktigt lipid-vattenblandningen från den ursprungliga sprutan till den tomma sprutan genom miniextruderapparaten. Upprepa detta steg 11 gånger för att bilda stadsjeepar. Överför stadsjeeparna till ett 1.5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: SUV-lösningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Sammansättning för CFE-reaktion
- Montera CFE-reaktionen genom att följa protokollet för cellfritt uttryck som tillhandahålls av tillverkaren med smärre ändringar som beskrivs nedan.
- Blanda 10 μl lösning 1 (innehållande aminosyror, NTP, tRNA och substrat för enzymer samt nödvändig buffert), 1 μl lösning 2 (proteiner i 20 % glycerol), 2 μl lösning 3 (ribosom (20 μM)), lämplig mängd DNA som kodar för löslig sfGFP-sfCherry(1-10)27 (nedan kallad löslig sfGFP), WT-GluR0-sfGFP eller PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 baspar), 1 μL murin RNAse-hämmare och 4 μL 5 mM SUV-lösning för membranproteiner eller 4 μL vatten för lösliga proteiner.
- Sänk reaktionens slutliga volym till 20 μL genom att tillsätta ultrarent avjoniserat vatten.
OBS: Vid montering av CFE-systemet måste alla komponenter hållas på is. Alla material är temperaturkänsliga och kan brytas ned om de når rumstemperatur.
- Inkubation och övervakning av CFE-reaktioner
- Överför CFE-lösningen till en 96-håls konisk V-bottenplatta. För att förhindra avdunstning under reaktionens gång, täck plattan med en tätningsfilm.
- Inkubera plattan vid 37 °C i en plattläsare i 4-5 timmar medan du övervakar CFE-reaktionen genom att mäta GFP-signalen med en förstärkning på 100 vid 488 nm/528 nm excitations-/emissionsvåglängder varannan minut.
2. CFE-reaktioner inkapslade i GUV:er
- Beredning av GUV yttre buffertlösning
- Blanda 1,5 μL 1 M spermidin, 37,5 μL 100 mM ATP, 25 μL 100 mM GTP, 12,5 μL 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M kreatinfosfat, 18 μL 1 M magnesiumacetat, 93,33 μL 3 M kaliumglutamat, 50 μl 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μl 332 mM folinsyra, 100 μL 2 M glukos och 50 μL från stamlösning av 6 mM blandning av var och en av de 20 aminosyrorna (framställd genom att följa det protokoll som beskrivs av Sun et al.28).
- Sänk lösningens slutliga volym till 1 ml genom att tillsätta ultrarenat avjoniserat vatten.
OBS: Alla komponenter måste förvaras på is. Tillsätt aminosyrablandningen i slutet för att undvika utarmning av aminosyror28. Lösningen kan alikvoteras i alikvoter på 330 μl och förvaras vid -20 °C tills den används.
- Beredning av lipid-i-olja-blandningen
OBS: detta steg måste utföras i ett dragskåp enligt säkerhetsinstruktionerna för att arbeta med kloroform.- Blanda 17,3 μl 25 mg/ml POPC-stamlösning i ett dragskåp och 1,08 μl 50 mg/ml poly(butadien)-b-poly(etylenoxid) (PEO-b-PBD) sampolymer i en 15 ml injektionsflaska av glas.
OBS: Den slutliga lipid-i-olja-lösningen innehåller 0,5 mM lipid med 95 % och 5 % POPC respektive PEO-b-PBD. PEO-b-PBD användes för att förbättra membranstabiliteten under proteinuttryck men hölls vid ett lågt molförhållande för att minska sampolymerens tendens att aggregera till miceller separata från lipidmolekyler29,30. - Blås försiktigt in en mild stråle av argongas i injektionsflaskan av glas samtidigt som du roterar injektionsflaskan för att förånga kloroformen.
- Pipettera över 1,2 ml lätt mineralolja i den 15 ml stora injektionsflaskan av glas som innehåller de torkade lipiderna.
- Blanda lipider och olja genom att virvla på maximal hastighet i 10-20 s. Den upplösta lipid-sampolymerblandningen kommer att se grumlig ut.
- För att säkerställa att alla möjliga lipidaggregat i oljan är fullständigt upplösta och dispergerade i oljan, placera injektionsflaskan av glas i en ugn vid cirka 50 °C i 20 minuter innan virvlar i ytterligare 10-20 s på maximal hastighet.
- Blanda 17,3 μl 25 mg/ml POPC-stamlösning i ett dragskåp och 1,08 μl 50 mg/ml poly(butadien)-b-poly(etylenoxid) (PEO-b-PBD) sampolymer i en 15 ml injektionsflaska av glas.
- CFE-reaktionsmontering och inkapsling (figur 1 sammanfattar följande steg).
- Bered 300 μl av den yttre GUV-lösningen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör genom att blanda 270 μL yttre CFE-buffertlösning beredd i steg 2.1, 15 μL 5 M NaCl och 15 μL 4,5 M KCl.
ANM.: Tillsätt i detta steg 0,45 μL 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT) till den yttre GUV-lösningen. Syftet med att tillsätta NaCl och KCl är att justera den yttre lösningens osmolalitet för att matcha den med den inre CFE-lösningen. Den exakta volymen av NaCl och KCl beror på den önskade osmolalitetsjusteringen. Man kan lägga till antingen NaCl eller KCl eller båda för att justera osmolaliteten. - Pipettera försiktigt över 300 μL lipid-i-olja-blandning ovanpå den yttre GUV-lösningen.
OBS: När du tillsätter lipid-oljeblandningen är det viktigt att oljan inte blandas med den vattenhaltiga yttre lösningen. Efter tillsatsen ska det finnas ett synligt gränssnitt mellan lipid-i-oljeblandningen och den yttre GUV-lösningen. - Inkubera gränsytan mellan olja och vatten vid rumstemperatur i 2 timmar så att lipidmonolagret kan bildas och stabiliseras vid gränsytan.
- Följ under tiden avsnitt 1.2.1 för att sätta ihop en CFE-reaktion som innehåller plasmid-DNA som kodar för membranproteinvarianterna eller löslig GFP. Byt ut 4 μL 5 mM SUV-lösning eller vatten mot 4 μL 1 M sackaros. Denna reaktion kommer att vara den inre lösningen för GUV.
OBS: En osmometer användes för att mäta osmolaliteten hos de inre och yttre lösningarna. Osmolaliteten hos den yttre lösningen justerades sedan i enlighet med detta genom tillsats av NaCl eller vatten. Osmolaliteten för CFE-reaktionen är typiskt runt 1600 mOsm/Kg. Genom att tillsätta sackaros till reaktionen ökar den inre lösningsdensiteten, vilket gör att vesiklarna kan färdas över gränsytan mellan olja och vatten under centrifugeringssteget. Ett alternativ till sackaros är Opti-Prep lösning för densitetsgradient. - Tillsätt 600 μL lipid-oljeblandning till mikrocentrifugröret som innehåller CFE-reaktionen och pipettera kraftigt upp och ner i ~1 minut för att emulgera reaktionen i lipid-i-olja-lösning och bilda lipidmonolagret runt syntetiska celler.
OBS: Den slutliga lösningen ska inte ha några bubblor och ska se ogenomskinlig ut. - Pipettera försiktigt den inre lösningenmulsionen ovanpå oljeskiktet i 1,5 ml mikrocentrifugröret där gränsytan mellan olja och vatten installerades.
OBS: Var försiktig så att du inte stör eller destabiliserar gränssnittet. - Centrifugera i 10 minuter vid 2 000 x g vid 4 °C.
OBS: Centrifugeringshastigheten optimerades för detta protokoll. Adir et al.31 rapporterade en annan centrifugeringshastighet. - När centrifugeringen är över, ta försiktigt bort överflödig olja och yttre lösning från mikrocentrifugröret med hjälp av en pipettor. Avlägsna den yttre lösningen tills den återstående volymen är ca 100 μL.
OBS: En pellet med GUV:er är vanligtvis synlig i botten av mikrocentrifugröret. Att det inte finns någon synlig pellet betyder dock inte nödvändigtvis att det inte finns något GUV-utbyte. Istället för att använda en pipetter kan överflödig olja ovanpå den yttre lösningen avlägsnas genom aspiration. Det är viktigt att se till att lipid-i-olja-lösningen är helt borttagen. Oljeförorening i GUV-lösning kan orsaka bilder av låg kvalitet. - Återsuspendera GUV-pelleten i den återstående 100 μL-lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ner. Överför sedan GUV-lösningen till en ren 96 brunns klar platt bottenplatta för att inkubera.
- Bered 300 μl av den yttre GUV-lösningen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör genom att blanda 270 μL yttre CFE-buffertlösning beredd i steg 2.1, 15 μL 5 M NaCl och 15 μL 4,5 M KCl.
3. Inkapslad CFE-reaktionsinkubation och avbildning
- Täck plattan med en tätningsfilm för att förhindra avdunstning. Inkubera plattan vid 37 °C i 5-6 timmar. Man kan använda en plattläsare och följa steg 1.3.2 för att förbereda plattläsaren för inkubationssteget.
- När inkubationen är över, placera plattan med 96 brunnar på avbildningssteget av ett inverterat mikroskop utrustat med en EMCCD-kamera (eller en sCMOS-kamera), DAQ-MX-styrd laser (eller ett integrerat laserkombinationssystem) och en CSU-X1 snurrande skiva konfokal (eller en laserskanningskonfokal). Fokusera på alla ROI som innehåller GUV:er och ta bilder vid en excitationsvåglängd på 488 nm med hjälp av ett Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA-objektiv.
- Spara bilder av GUV:er i .tiff format.
- Öppna bilderna i ett bildbehandlingsprogram (t.ex. ImageJ eller Fiji). Öppna inställningspanelen för ljusstyrka/kontrast . Justera ljusstyrkan och kontrasten till lämpliga inställningar som gör fluorescerande proteiner synliga.
- Om målet är att jämföra signalintensiteten för olika uttryckta proteiner, stapla först enskilda bilder av GUV:er som innehåller olika proteiner med hjälp av panelen Bilder till stapling som finns under undermenyn Bild > Staplar . Justera sedan ljusstyrkan och kontrasten för alla bilder med hjälp av panelen Ljusstyrka/kontrast .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före inkapsling av CFE-reaktionerna uttrycktes två varianter av GluR0-sfGFP som hade nativa peptider och proteorhodopsinsignalpeptider (signalpeptidsekvenser presenteras i tilläggstabell 1) och löslig sfGFP individuellt i bulkreaktioner, och deras uttryck övervakades genom att detektera sfGFP-signalen med hjälp av en plattläsare (Figur 2A). Membranproteiner uttrycktes i frånvaro eller närvaro av 100 nm stadsjeepar. Dessutom, med hjälp av en kalibreringskurva som korrelerar sfGFP-signalen till dess koncentration (tilläggsfigur 1), uppskattades koncentrationerna av syntetiserade proteiner (tilläggstabell 2). Det är tydligt att löslig sfGFP hade det högsta uttrycket av alla tre proteinerna, vilket tyder på att uttrycket av membranproteiner belastar CFE-systemet, vilket bromsar reaktionen och sänker dess utbyte. Dessutom visade reaktioner som uttryckte membranproteiner i närvaro av stadsjeepar i genomsnitt högre sfGFP-signal jämfört med reaktioner som saknade stadsjeepar. Denna observation ligger i linje med resultaten av Steinküher et al., som visade att uttrycket av membranproteiner minskar CFE-systemets förmåga att producera proteiner23. Icke desto mindre, med tanke på den framgångsrika demonstrationen av proteinuttryck i bulk CFE-reaktion, kan man resonera att inkapslad CFE också kommer att syntetisera proteiner inuti GUVs.
Därefter kapslades individuella CFE-reaktioner in i GUV:er med hjälp av den inverterade emulsionsmetoden för att uttrycka varianter av GluR0, nämligen WT-GluR0, PRSP-GluR0 och löslig sfGFP. Medan WT-GluR0, som har GluR0 nativ signalpeptid, uppvisade utmärkt uttryck och membranlokalisering (Figur 2B, vänster panel), visade dess motsvarighet, PRSP-GluR0, som har proteorhodopsin N-terminal signalpeptid, inte liknande stark membranlokalisering. PRSP-GluR0 visade sig vara mer benägen att aggregering och punktbildning (Figur 2B, mittpanelen). Som förväntat uttrycktes löslig sfGFP i GUV:er och stannade i GUV-lumen (Figur 2B, högra panelen; se Kompletterande Figur 2 för bilder av kohorter av GUV:er).
Figur 1: Experimentella steg för inverterad emulsion. (1) Steg 2.3.1 till och med steg 2.3.3 i protokollet visualiseras för att demonstrera sammansättningen av lipidmonoskiktet vid gränsytan mellan lipid-oljeblandningen och den yttre buffertlösningen. (2) Visualisering av steg 2.3.5 i protokollet visas här för att representera bildandet av lipidmonolagret runt emulgerade droppar som kapslar in den inre CFE-lösningen. (3) I steg 2.3.6 i protokollet visas tillsatsen av monolager-GUV:er till mikrocentrifugröret med lipidmonolagret vid gränsytan mellan en lipid-oljeblandning och en yttre buffertlösning. (4) Steg 2.3.7 visas här, där centrifugeringen leder till att en GUV-pellet bildas i den yttre lösningen. (5) Steg 2.3.8 visas här, vilket indikerar processen för att avlägsna överskottet av lipid-i-olja-blandningen och den yttre lösningen. (6) Slutligen visas steg 2.3.9 här, där GUV-pelleten återsuspenderas i den yttre lösningen och GUV:erna är klara för inkubation, följt av avbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Proteinuttryck i bulk CFE-reaktioner och i GUV:er som kapslar in CFE-reaktioner. (A) Fluorescensavläsningar av enskilda CFE-bulkreaktioner som uttrycker WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP och löslig sfGFP. Den lösliga sfGFP-grafen representerar signalen från en 2,5 μL-reaktion (standardreaktionsvolymen är 20 μL) för att undvika övermättnad av plattläsarens mätningar. Data presenteras som medelvärde ± S.D, n = 3. (B) Vänster: En representativ konfokalbild av en GUV-inkapslande CFE-reaktion som uttrycker WT-GluR0-sfGFP. Mitten: En representativ konfokalbild av GUV:er som kapslar in CFE-reaktion som uttrycker PRSP-GluR0-sfGFP. Höger: En representativ konfokalbild av en GUV-inkapslande CFE-reaktion som uttrycker löslig sfGFP. Skalstreck: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Kalibreringskurvan för sfGFP-signalen och dess motsvarande linjära regressionsanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Representativ konfokalbild av kohorter av GUV:er som uttrycker (vänster) WT-GluR0-sfGFP, (mitten) PRSP-GluR0-sfGFP och (höger) löslig sfGFP. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Aminosyrasekvensen för peptider med vildtyps- och proteorhodopsinsignaler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 2: Koncentrationen av syntetiserade proteiner i bulk CFE-reaktioner. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Praktiskt taget alla cellulära processer som är beroende av överföring av molekyler eller information över cellmembranet, som cellsignalering eller cellexcitation, kräver membranproteiner. Således har rekonstitueringen av membranproteiner blivit den huvudsakliga flaskhalsen för att realisera olika syntetiska celldesigner för olika applikationer. Traditionell detergentmedierad rekonstituering av membranproteiner i biologiska membran kräver GUV-genereringsmetoder såsom mild svullnad eller elektroformation. Svällningsmetoder ger vanligtvis små vesiklar, och elektrobildningsutbytet minskar avsevärt när komplicerade lösningar, vilket ofta är fallet vid generering av syntetiska celler, kapslas in32. Dessutom löser rengöringsmedel membranproteinet, och om de avlägsnas under beredningsprocessen kan proteinet veckas fel33,34. Å andra sidan bygger det tillvägagångssätt som presenteras här på den cotranslationella inkorporeringen av membranproteinet i lipiddubbelskiktet, vilket mer liknar den naturliga proteinbiogenesvägen i celler22.
Ur teknisk synvinkel är det presenterade protokollet fördelaktigt jämfört med andra vanliga inkapslingsmetoder, såsom elektroformation och kontinuerlig droppgränssnittskorsning 7,8,35,36 (cDICE), för enklare implementering eftersom den enda laboratorieutrustning som krävs för GUV-generering är en centrifug. I motsats till elektroformation möjliggör den inverterade emulsionsmetoden inkapsling av olika kombinationer av molekyler med olika koncentrationer. Dessutom, jämfört med den ursprungliga inverterade emulsionstekniken25, genererar detta tillvägagångssätt mer stabila GUV:er som är lämpliga för inkapsling av CFE-lysat eller PURE-system. Den högre GUV-stabiliteten beror på närvaron av diblocksampolymer i sammansättningen av GUV-membran37 samt den långa inkubationen av olje-vattengränssnittet som gör att gränssnittet kan mättas med lipidmolekyler. Slutligen, i motsats till mikrofluidikmetoder, kräver protokollet som presenteras här inte små kanaler och slangar. Därför kan CFE-reaktionen kapslas in så snart den är monterad, och den kortare tiden för GUV-montering på grund av brist på flöde och eventuell igensättning förhindrar för tidig start av CFE-reaktionen. Även om demonstrationen av membranproteinuttryck i detta protokoll är exklusiv för PUREfrex-reaktioner, kan man utöka denna metod för att syntetisera proteiner med hjälp av olika tillgängliga CFE-system, såsom lysatbaserade bakteriella eller däggdjurs-CFE-system.
Det tillvägagångssätt som presenteras här har begränsningar som orsakas av den oljeberoende karaktären hos GUV-bildningsprocessen och avsikten att ha stabila GUV:er. Detta tillvägagångssätt är vanligtvis längre jämfört med andra metoder, såsom cDICE eller mikrofluidik, på grund av den långa inkubationstiden för olje-vattengränssnittet som krävs för gränsskiktsstabilisering och högt GUV-utbyte. Dessutom är lipidsammansättningen i första hand begränsad till POPC med små doser av andra lipider eller blocksampolymerer, medan andra metoder, såsom elektrobildning, är mer lämpade för inkorporering av lipider med olika fysikaliska och kemiska egenskaper. Medan GUV-membransammansättningen i denna metod är en blandning av POPC och PBD-PEO för att maximera CFE-utbytet, kan möjliga variationer i GUV-membransammansättningen testas. Ytterligare optimering av parametrarna kan dock krävas för andra membranproteiner. Eftersom droppemulgeringen sker genom manuell pipettering är de GUV:er som genereras med denna metod polydispersiva och ganska heterogena i storlek. Vidare kan det faktum att lipider löses upp i den organiska fasen ibland orsaka ett lager av olja mellan de två bladen i GUV-membranet eller förorena avbildningskammaren med olja som kan vara skadligt för bildkvaliteten. En möjlig lösning på utmaningen med restolja är att ersätta mineralolja med ett flyktigt organiskt lösningsmedel, såsom dietyleter, som visats av Tsumoto et al.38, för att förlita sig på lösningsmedelsindunstunstning tillsammans med centrifugering under GUV-bildning.
Även om det inte finns någon demonstration av kanalfunktion i detta arbete, inspirerat av tidigare analyser som använts för att undersöka rekonstituerad mekano- eller ljuskänslig kanalfunktionalitet, skisseras en fluorescensmikroskopibaserad analys. Öppningen av GluR0-kanalen rapporteras öka membrankonduktiviteten för K+ joner24. Eftersom CFE-reaktioner redan innehåller en hög koncentration av K+, kommer typiska kaliumindikatorer inte att vara lämpliga för att bedöma kanalens funktionalitet. Men eftersom kaliuminflödet förändrar membranpotentialen kan känsliga membranpotentialindikatorer som DiBAC4(3)22 eller BeRST 139 rapportera GluR0-aktivitet i närvaro av glutamat.
Framgångsrik rekonstitution av membranproteiner i syntetiska celler öppnar upp för många möjligheter att skapa syntetiska celler med oöverträffade förmågor som bättre efterliknar naturliga celler. En stor nackdel med syntetiska celler är att de inte kan reproducera och återvinna energi. Men med ljus- och kemikalieberoende energiregenereringssystem som är starkt beroende av membranproteiner, kan man föreställa sig långvariga syntetiska celler40. Att använda CFE-system gör det möjligt att rekonstituera flera membranproteiner som tillsammans kan utföra vissa uppgifter. Till exempel kan rekonstitution av en ligandreglerad jonkanal som liknar GluR0 som beskrivs här, tillsammans med olika spänningsstyrda jonkanaler, leda till byggandet av en exciterbar neuronliknande syntetisk cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
APL bekräftar stöd från National Science Foundation (EF1935265), National Institutes of Health (R01-EB030031 och R21-AR080363) och Army Research Office (80523-BB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
| 96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
| Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
| Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
| Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
| Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
| PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
| pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
| PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
| Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
| Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
| VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
- Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
- Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
- Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
- Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
- Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
- Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
- Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
- Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
- Schneider, B., et al.
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
- Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
- Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
- Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
- Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
- Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
- Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
- Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
- Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
- Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
- Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
- van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
- Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
- Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).
