Summary
이 프로토콜은 모델 막 단백질을 지질 이중층으로 합성하고 통합하는 연구를 위해 거대 단층 소포(GUV) 내에 CFE(cell-free expression) 시스템을 캡슐화하는 데 사용되는 역에멀젼 방법을 설명합니다.
Abstract
CFE(Cell-Free Expression) 시스템은 합성 세포의 생체 감지 및 에너지 재생과 같은 세포 기능의 생체 모방을 가능하게 하는 합성 생물학의 강력한 도구입니다. 그러나 광범위한 세포 과정을 재구성하려면 막 단백질을 합성 세포의 막으로 성공적으로 재구성해야 합니다. 용해성 단백질의 발현은 일반적으로 일반적인 CFE 시스템에서 성공적이지만, 합성 세포의 지질 이중층에서 막 단백질을 재구성하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 여기에서는 합성 세포 내부의 CFE 반응의 캡슐화 및 배양을 기반으로 모델 합성 세포로서 거대 단층 소포체(GUV)에서 모델 막 단백질인 박테리아 글루타메이트 수용체(GluR0)를 재구성하는 방법을 시연합니다. 이 플랫폼을 활용하여 GluR0의 N-말단 신호 펩타이드를 프로테오로돕신 신호 펩타이드로 치환하는 것이 GluR0를 하이브리드 GUV의 막으로의 성공적인 동시 번역 전위에 미치는 효과를 입증합니다. 이 방법은 합성 세포에서 다양한 막 단백질의 세포 없는 재구성을 허용하는 강력한 절차를 제공합니다.
Introduction
상향식 합성생물학은 지난 10년 동안 생명공학, 약물 전달 및 재생 의학 분야에서 수많은 잠재적 응용 분야가 있는 신흥 분야로 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다 1,2. 특히 상향식 합성생물학의 초석으로서의 합성세포의 개발은 합성세포의 유망한 응용과 체외 생물물리학 연구를 용이하게 하는 세포와 같은 물리적, 생화학적 특성으로 인해 광범위한 과학계를 매료시켰습니다 3,4,5,6 . 합성 세포는 종종 다양한 생물학적 과정이 재현되는 세포 크기의 거대 단층 소포(GUV)에서 엔지니어링됩니다. 세포 세포골격재구성 (Reconstitution of cell cytoskeleton) 7,8, 광 의존 에너지 재생 (light-dependent energy regeneration) 9, 세포 통신(cellular communication) 10,11 및 생체 감지 (biosensing12)는 합성 세포에서 세포와 같은 행동을 재구성하기 위한 노력의 예입니다.
일부 세포 과정은 용해성 단백질에 의존하지만, 감지 및 통신과 같은 자연 세포의 많은 특성은 종종 이온 채널, 수용체 및 수송체를 포함한 막 단백질을 사용합니다. 합성 세포 개발의 주요 과제는 막 단백질의 재구성입니다. 지질 이중층에서 막 단백질을 재구성하는 기존의 방법은 세제 매개 정제에 의존하지만, 이러한 방법은 힘들고 발현 숙주에 독성이 있는 단백질에는 비효율적이거나 GUV의 막 단백질 재구성에 적합하지 않은 경우가 많습니다13.
단백질 발현을 위한 대체 방법은 무세포 발현(CFE) 시스템입니다. CFE 시스템은 세포 용해물 또는 정제된 전사-번역 기계를 사용하여 다양한 단백질의 시험관 내 발현을 가능하게 하는 합성 생물학의 강력한 도구였습니다14. CFE 시스템은 또한 GUV에 캡슐화될 수 있으므로 광 수확 합성 세포9 또는 기계감응성 바이오센서(15,16)의 생성과 같은 다양한 응용 분야에 대해 프로그래밍할 수 있는 구획화된 단백질 합성 반응을 가능하게 합니다. 재조합 단백질 발현 방법과 유사하게, 막 단백질 발현은 CFE 시스템에서 까다롭습니다17. CFE 시스템의 응집, 잘못된 접힘 및 번역 후 변형 부족은 CFE 시스템을 사용한 성공적인 막 단백질 합성을 방해하는 주요 병목 현상입니다. CFE 시스템을 사용한 상향식 막 단백질 재구성의 어려움은 부분적으로 신호 펩타이드, 신호 인식 입자, translocons 및 chaperoning 분자에 의존하는 복잡한 막 단백질 생물 발생 경로가 없기 때문입니다. 그러나 최근 여러 연구에서 번역 중 마이크로솜 또는 리포솜과 같은 막성 구조의 존재가 성공적인 막 단백질 발현을 촉진한다고 제안했습니다 18,19,20,21. 게다가, Eaglesfield et al. 및 Steinküher et al.은 막 단백질의 N-말단에 신호 펩티드로 알려진 특정 소수성 도메인을 포함하면 그 발현을 크게 향상시킬 수 있음을 발견했습니다22,23. 이러한 연구는 GUV 멤브레인의 존재 하에서 단백질 번역이 발생하고 적절한 N-말단 신호 펩타이드가 활용되면 합성 세포에서 막 단백질 재구성의 문제를 극복할 수 있음을 시사합니다.
여기에서는 GUV에서 막 단백질 재구성을 위한 재조합 요소(PURE) CFE 반응을 사용하여 단백질 합성을 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 박테리아 글루타메이트 수용체24 (GluR0)를 모델 막 단백질로 선택하고 N-말단 신호 펩타이드가 막 재구성에 미치는 영향을 연구합니다. Eaglesfield et al.22에 의해 막 단백질 재구성 효율이 향상되는 것으로 밝혀진 프로테오호돕신 신호 펩타이드의 효과는 PRSP-GluR0로 표시된 GluR0의 돌연변이 변이체를 구성하고, 그 발현 및 막 국소화를 본래 신호 펩타이드를 품고 있는 야생형 GluR0(이하 WT-GluR0라고 함)로 비교하여 조사합니다. 이 프로토콜은 CFE 캡슐화를 위해 견고하게 만드는 변형을 가미한 반전 에멀젼 방법(inverted emulsion method)(25)을 기반으로 한다. 제시된 방법에서, CFE 반응은 먼저 CFE 시스템을 포함하고 지질 단층에 의해 안정화되는 미크론 크기의 액적을 생성하는 지질 내 오일 용액을 사용하여 유화됩니다. 그런 다음 에멀젼 방울은 다른 지질 단층으로 포화된 오일-물 계면 위에 층을 이룹니다. 그런 다음 에멀젼 방울은 원심력을 통해 오일-물 계면을 가로질러 이동하게 됩니다. 이 과정을 통해 액적은 또 다른 단층을 얻어 이중층 지질 소포를 생성합니다. 그런 다음 CFE 반응을 포함하는 GUV를 배양하고, 그 동안 막 단백질이 발현되어 GUV 막에 통합됩니다. 이 프로토콜은 GluR0의 cell-free 발현을 위해 지정되었지만, 다른 막 단백질의 cell-free synthesis 또는 cytoskeleton reconstitution 또는 membrane fusion studies와 같은 다른 synthetic cell 응용에 사용할 수 있다26.
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Protocol
이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나와 있습니다.
1. 작은 단층 소포(SUV)가 있는 경우 벌크 CFE 반응
- SUV 준비
알림: 이 단계는 클로로포름 작업에 대한 안전 지침에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다.- 클로로포름에 용해된 76μL의 25mg/mL POPC 원액을 전사하여 유리 바이알에 5mM 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린(POPC) SUV를 준비합니다.
- 유리 바이알을 부드럽게 회전시키면서 바이알에 아르곤을 부드럽게 불어넣어 바닥에 건조된 지질 막을 형성합니다. 다음으로, 과도한 클로로포름을 증발시키기 위해 캡을 느슨하게 조인 상태에서 유리 바이알을 데시케이터로 옮깁니다.
- 유리 바이알을 데시케이터에 1시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 0.5mL의 초순수 탈이온수를 첨가하여 약 2분 동안 지질막과 와류를 용해시킵니다.
- 두 개의 필터 지지대를 탈이온수에 담그고 각 내부 멤브레인 지지대에 놓아 미니 압출 장치를 설정합니다. 그런 다음 100nm 폴리카보네이트 필터를 담그고 압출기 외부 케이싱과 리테이너 너트로 함께 고정되는 두 개의 내부 멤브레인 지지대 사이에 놓습니다. 이 설정을 압출기 스탠드에 놓습니다.
- 1mL 기밀 주사기 2개를 초순수 탈이온수로 3회 세척합니다.
- 지질-물 혼합물 샘플을 1mL 기밀 주사기 중 하나에 넣고 스윙 암 클립을 사용하여 주사기를 제자리에 고정하여 미니 압출기의 한쪽 끝에 놓습니다. 두 번째 주사기를 미니 압출기의 다른 쪽 끝에 삽입하고 완전히 눌렸는지 확인합니다.
알림: 주사기에 지질-물 혼합물을 넣을 때 미니 압출기를 통과시키기 전에 주사기에 공기가 없는지 확인하십시오. - 미니 압출기 장치를 통해 원래 주사기의 지질-물 혼합물을 빈 주사기로 부드럽게 통과시킵니다. 이 단계를 11번 반복하여 SUV를 만듭니다. SUV를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
참고: SUV 용액은 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
- CFE 반응 어셈블리
- 제조업체에서 제공한 cell-free 발현 프로토콜에 따라 CFE 반응을 조립하고 아래에 자세히 설명된 약간의 수정을 가합니다.
- 용액 1 10μL(효소용 아미노산, NTP, tRNA 및 기질 및 필요한 완충액 포함), 용액 2 1μL(20% 글리세롤의 단백질), 용액 3 2μL(리보솜(20μM)), 용해성 sfGFP-sfCherry(1-10)27(이하 용해성 sfGFP라고 함)에 대한 DNA 인코딩의 적정량, WT-GluR0-sfGFP 또는 PRSP-GluR0-sfGFP(10-60ng/1000 염기쌍)를 혼합합니다. 1 μL murine RNAse inhibitor 및 막 단백질의 경우 4 μL의 5 mM SUV 용액 또는 용해성 단백질의 경우 4 μL 물.
- 초순수 탈이온수를 추가하여 반응의 최종 부피를 20μL로 만듭니다.
알림: CFE 시스템을 조립할 때 모든 구성 요소를 얼음 위에 보관해야 합니다. 모든 재료는 온도에 민감하며 실온에 도달하면 성능이 저하될 수 있습니다.
- CFE 반응 배양 및 모니터링
- CFE 용액을 96웰 원추형 V-바닥 플레이트로 옮깁니다. 반응 과정에서 증발을 방지하려면 밀봉 필름으로 플레이트를 덮으십시오.
- 37°C에서 플레이트를 4-5시간 동안 배양하면서 2분마다 488nm/528nm 여기/방출 파장에서 100의 이득으로 GFP 신호를 측정하여 CFE 반응을 모니터링합니다.
2. GUV에 캡슐화된 CFE 반응
- GUV 외부 완충 용액의 제조
- 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 1.5μL의 1M 스퍼미딘, 37.5mL의 100mM ATP, 25μL의 100mM GTP, 12.5mL의 100mM CTP, 12.5μL의 100mM UTP, 1M 크레아틴 인산염 25μL, 1M 마그네슘 아세테이트 18μL, 3M 글루타민산칼륨 93.33μL를 혼합합니다. 50 μL의 1 M HEPES KOH (pH 7.4), 1.15 μL의 332 mM 폴린산, 100 μL의 2 M 글루코스, 및 20 개의 아미노산 각각의 6 mM 혼합물의 원액에서 50 μL (Sun et al.28에 의해 설명 된 프로토콜에 따라 제조).
- 초순도 탈이온수를 추가하여 용액의 최종 부피를 1mL로 만듭니다.
알림: 모든 구성 요소는 얼음 위에 보관해야 합니다. 아미노산 고갈을 피하기 위해 끝에 아미노산 혼합물을 추가하십시오28. 용액은 330 μL 분취액으로 분주할 수 있으며 사용할 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 지질-인-오일 혼합물의 제조
알림: 이 단계는 클로로포름 작업에 대한 안전 지침에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다.- 흄 후드에서 17.3μL의 25mg/mL POPC 원액과 1.08μL의 50mg/mL 폴리(부타디엔)-b-폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO-b-PBD) 공중합체를 15mL 유리 바이알에 혼합합니다.
참고: 최종 지질 내 용액에는 각각 95% 및 5% POPC 및 PEO-b-PBD가 포함된 0.5mM 지질이 포함되어 있습니다. PEO-b-PBD는 단백질 발현 중 막 안정성을 향상시키는 데 사용되었지만, 지질 분자29,30에서 분리된 미셀로 응집되는 공중합체의 경향을 줄이기 위해 낮은 몰 비율로 유지되었습니다. - 유리 바이알에 아르곤 가스를 부드럽게 불어내면서 바이알을 회전시켜 클로로포름을 증발시킵니다.
- 1.2mL의 경질 미네랄 오일을 건조된 지질이 들어 있는 15mL 유리 바이알에 피펫팅합니다.
- 10-20초 동안 최대 속도로 소용돌이쳐 지질과 오일을 혼합합니다. 용해된 지질-공중합체 혼합물은 뿌옇게 보입니다.
- 오일에 있는 가능한 모든 지질 응집체가 완전히 용해되어 오일 전체에 분산되도록 하려면 유리 바이알을 약 50°C의 오븐에 20분 동안 넣은 후 최대 속도로 추가로 10-20초 동안 소용돌이칩니다.
- 흄 후드에서 17.3μL의 25mg/mL POPC 원액과 1.08μL의 50mg/mL 폴리(부타디엔)-b-폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO-b-PBD) 공중합체를 15mL 유리 바이알에 혼합합니다.
- CFE 반응 조립 및 캡슐화(그림 1 은 다음 단계를 요약함).
- 2.1단계에서 제조한 CFE 외부 완충 용액 270μL, 5M NaCl 15μL 및 4.5M KCl 15μL를 혼합하여 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 GUV 외부 용액 300μL를 준비합니다.
참고: 이 단계에서 GUV 외부 용액에 0.45μL의 1M 1,4-디티오트레이톨(DTT)을 추가합니다. NaCl 및 KCl을 첨가하는 목적은 외부 용액의 삼투압을 내부 CFE 용액과 일치하도록 조정하는 것입니다. NaCl 및 KCl의 정확한 부피는 원하는 삼투압 조정에 따라 다릅니다. 삼투압을 조정하기 위해 NaCl 또는 KCl 또는 둘 다를 추가할 수 있습니다. - GUV 외부 용액 위에 300μL의 지질 내 오일 혼합물을 부드럽게 피펫팅합니다.
알림: 지질-오일 혼합물을 추가할 때 오일이 외부 수용액과 혼합되지 않는 것이 중요합니다. 첨가 후, 지질 내 오일 혼합물과 GUV 외부 용액 사이에 가시적인 계면이 있어야 합니다. - 오일-물 계면을 실온에서 2시간 동안 배양하여 지질 단층이 계면에서 형성되고 안정화될 수 있도록 합니다.
- 한편, 섹션 1.2.1에 따라 막 단백질 변이체 또는 용해성 GFP를 암호화하는 플라스미드 DNA를 포함하는 CFE 반응을 조립합니다. 4μL의 5mM SUV 용액 또는 물을 4μL의 1M 자당으로 교체합니다. 이 반응은 GUV 내부 솔루션이 됩니다.
참고: 삼투압계는 내부 및 외부 용액의 삼투압을 측정하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 외부 용액의 삼투압을 NaCl 또는 물의 첨가에 의해 적절하게 조정하였다. CFE 반응의 삼투압은 일반적으로 약 1600mOsm/Kg입니다. 반응에 자당을 추가하면 내부 용액 밀도가 증가하여 원심분리 단계에서 소포가 오일-물 계면을 가로질러 이동할 수 있습니다. 자당의 대안은 Opti-Prep 밀도 그래디언트 용액입니다. - CFE 반응이 포함된 마이크로 원심분리기 튜브에 600μL의 지질 오일 혼합물을 추가하고 ~1분 동안 위아래로 세게 피펫팅하여 지질 내 오일 용액에서 반응을 유화하고 합성 세포 주위에 지질 단층을 형성합니다.
참고: 최종 솔루션에는 거품이 없어야 하며 불투명하게 보여야 합니다. - 오일-물 계면이 설정된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브의 오일 층 위에 있는 내부 용액 에멀젼을 부드럽게 피펫팅합니다.
참고: 인터페이스를 방해하거나 불안정하게 만들지 않도록 주의하십시오. - 4 °C에서 2,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
참고: 원심분리 속도는 이 프로토콜에 맞게 최적화되었습니다. Adir et al.31 은 다른 원심분리 속도를 보고했습니다. - 원심분리가 끝나면 피펫터를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 여분의 오일과 외부 용액을 조심스럽게 제거합니다. 남은 부피가 약 100μL가 될 때까지 외부 용액을 제거합니다.
알림: GUV의 펠릿은 일반적으로 미세 원심분리기 튜브의 바닥에서 볼 수 있습니다. 그러나 눈에 보이는 펠릿이 없다고 해서 반드시 GUV 수율이 없다는 의미는 아닙니다. 피펫터를 사용하는 대신 외부 용액 위에 있는 과도한 오일을 흡인으로 제거할 수 있습니다. 오일 내 지질 용액이 완전히 제거되었는지 확인하는 것이 중요합니다. GUV 용액의 오일 오염은 이미지 품질을 저하시킬 수 있습니다. - GUV 펠릿을 나머지 100μL 용액에 상하로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킵니다. 다음으로, GUV 용액을 깨끗한 96웰의 투명한 평평한 바닥 플레이트에 옮겨 배양합니다.
- 2.1단계에서 제조한 CFE 외부 완충 용액 270μL, 5M NaCl 15μL 및 4.5M KCl 15μL를 혼합하여 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 GUV 외부 용액 300μL를 준비합니다.
3. 캡슐화된 CFE 반응 배양 및 이미징
- 증발을 방지하기 위해 밀봉 필름을 사용하여 플레이트를 덮으십시오. 플레이트를 37°C에서 5-6시간 동안 배양합니다. 플레이트 리더를 사용하고 1.3.2 단계에 따라 배양 단계를 위해 플레이트 리더를 준비할 수 있습니다.
- 배양이 끝나면 EMCCD 카메라(또는 sCMOS 카메라), DAQ-MX 제어 레이저(또는 통합 레이저 결합기 시스템) 및 CSU-X1 회전 디스크 컨포칼(또는 레이저 스캐닝 컨포칼)이 장착된 도립 현미경의 이미징 스테이지에 96웰 플레이트를 놓습니다. GUV를 포함하는 모든 ROI에 집중하고 Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA 대물렌즈를 사용하여 488nm의 여기 파장에서 이미지를 캡처합니다.
- GUV의 이미지를 .tiff 형식으로 저장합니다.
- 이미지 처리 소프트웨어(예: ImageJ 또는 Fiji)에서 이미지를 엽니다. 밝기/대비 설정 패널을 엽니다. 형광 단백질을 볼 수 있도록 밝기와 대비를 적절한 설정으로 조정합니다.
- 서로 다른 발현된 단백질의 신호 강도를 비교하는 것이 목표인 경우 먼저 Image > Stacks 하위 메뉴 아래에 있는 Images to Stack 패널을 사용하여 서로 다른 단백질을 포함하는 GUV의 개별 이미지를 스택합니다. 그런 다음 Brightness/Contrast 패널을 사용하여 모든 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.
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Representative Results
CFE 반응을 캡슐화하기 전에, 네이티브 및 프로테오로돕신 신호 펩타이드(신호 펩타이드 서열은 보충 표 1에 제시됨)를 함유하는 GluR0-sfGFP의 두 가지 변형체와 용해성 sfGFP를 벌크 반응에서 개별적으로 발현하고, 플레이트 리더를 사용하여 sfGFP 신호를 검출하여 발현을 모니터링했습니다(그림 2A). 막 단백질은 100nm SUV의 부재 또는 존재 하에서 발현하였다. 또한, sfGFP 신호를 그 농도와 상관시키는 보정 곡선을 사용하여(보충 그림 1), 합성된 단백질의 농도를 추정하였다(보충 표 2). 분명히, 용해성 sfGFP는 세 가지 단백질 중에서 가장 높은 발현을 보였는데, 이는 막 단백질의 발현이 CFE 시스템에 부담을 주어 반응을 늦추고 수율을 낮춘다는 것을 시사합니다. 또한, 평균적으로 SUV가 있는 상태에서 막 단백질을 발현하는 반응은 SUV가 없는 반응에 비해 더 높은 sfGFP 신호를 보여주었습니다. 이 관찰은 막 단백질의 발현이 단백질을 생성하는 CFE 시스템의 용량을 감소시킨다는 것을 보여준 Steinküher et al.의 발견과 일치합니다23. 그럼에도 불구하고 벌크 CFE 반응에서 단백질 발현의 성공적인 입증을 감안할 때 캡슐화된 CFE가 GUV 내부에서도 단백질을 합성할 것이라고 추론할 수 있습니다.
다음으로, 개별 CFE 반응을 역 에멀젼 방법을 사용하여 GUV에 캡슐화하여 GluR0의 변이체, 즉 WT-GluR0, PRSP-GluR0 및 용해성 sfGFP를 발현했습니다. GluR0 네이티브 신호 펩타이드를 함유한 WT-GluR0는 우수한 발현 및 막 국소화를 보여주었지만(그림 2B, 왼쪽 패널), 프로테오로돕신 N-말단 신호 펩타이드를 함유한 PRSP-GluR0는 이와 유사한 강력한 막 국소화를 보여주지 않았습니다. PRSP-GluR0는 응집 및 반점 형성에 더 취약한 것으로 나타났습니다(그림 2B, 중간 패널). 예상한 대로, 용해성 sfGFP는 GUV에서 발현되었고 GUV 루멘에 머물렀다(그림 2B, 우측 패널; GUV의 코호트 이미지는 보충 그림 2 참조).
그림 1: 도립 에멀젼의 실험 단계. (1) 프로토콜의 2.3.1단계부터 2.3.3단계까지를 시각화하여 지질-오일 혼합물과 외부 완충 용액의 계면에서 지질 단층의 조립을 보여줍니다. (2) 프로토콜의 2.3.5 단계의 시각화는 내부 CFE 용액을 캡슐화하는 유화 액적 주변의 지질 단층의 형성을 나타내기 위해 여기에 표시됩니다. (3) 프로토콜의 단계 2.3.6은 지질-오일 혼합물 및 외부 완충 용액의 계면에서 지질 단층을 사용하여 미세 원심분리기 튜브에 단층 GUV를 추가하는 것을 보여줍니다. (4) 2.3.7 단계가 여기에 설명되어 있으며, 여기서 원심 분리는 외부 용액에 GUV 펠릿을 형성합니다. (5) 2.3.8 단계가 여기에 표시되어 있으며, 이는 과잉 지질 내 오일 혼합물 및 외부 용액을 제거하는 과정을 나타냅니다. (6) 마지막으로, 2.3.9 단계가 여기에 묘사되어 있으며, 여기서 GUV 펠릿은 외부 용액에 재현탁되고 GUV는 배양 준비가 된 후 이미징이 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 벌크 CFE 반응 및 CFE 반응을 캡슐화하는 GUV에서의 단백질 발현. (A) WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP 및 용해성 sfGFP를 발현하는 개별 벌크 CFE 반응의 형광 판독값. 용해성 sfGFP 그래프는 플레이트 리더 측정의 과포화를 방지하기 위해 2.5μL 반응(표준 반응 부피는 20μL)의 신호를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± S.D, n = 3으로 표시됩니다. (B) 왼쪽: WT-GluR0-sfGFP를 발현하는 GUV 캡슐화 CFE 반응의 대표적인 컨포칼 이미지. 중간: PRSP-GluR0-sfGFP를 발현하는 CFE 반응을 캡슐화하는 GUV의 대표적인 공초점 이미지. 오른쪽: 용해성 sfGFP를 발현하는 GUV 캡슐화 CFE 반응의 대표적인 컨포칼 이미지. 눈금 막대: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: sfGFP 신호 보정 곡선 및 해당 선형 회귀 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: (왼쪽) WT-GluR0-sfGFP, (가운데) PRSP-GluR0-sfGFP 및 (오른쪽) 가용성 sfGFP를 발현하는 GUV 코호트의 대표 컨포칼 이미지. 눈금 막대: 10 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 야생형 및 프로테오호돕신 신호 펩타이드의 아미노산 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 벌크 CFE 반응에서 합성된 단백질의 농도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세포 신호 전달 또는 세포 여기와 같이 세포막을 통한 분자 또는 정보의 전달에 의존하는 거의 모든 세포 과정에는 막 단백질이 필요합니다. 따라서 막 단백질의 재구성은 다양한 응용 분야에 대한 다양한 합성 세포 설계를 구현하는 데 있어 주요 병목 현상이 되었습니다. 생체막에서 막 단백질의 전통적인 세제 매개 재구성에는 부드러운 팽창 또는 전기 형성과 같은 GUV 생성 방법이 필요합니다. 팽윤 접근법은 일반적으로 작은 크기의 소포를 생성하며, 합성 세포를 생성할 때 종종 발생하는 복잡한 용액이 캡슐화될 때 전기형성 수율이 크게 떨어집니다32. 또한, 세제는 막 단백질을 용해시키며, 재구성 과정에서 세제가 제거되면 단백질이 잘못 접힐 수 있습니다33,34. 반면에, 여기에 제시된 접근법은 막 단백질이 지질 이중층으로의 동시 번역 통합에 의존하며, 이는세포 22의 자연 단백질 생물 발생 경로와 더 유사합니다.
기술적 관점에서, 제시된 프로토콜은 전기형성 및 연속 액적 계면 교차 캡슐화 7,8,35,36(cDICE)과 같은 다른 일반적인 캡슐화 방법에 유리하며, GUV 생성에 필요한 유일한 실험실 장비가 원심분리기이므로 구현이 더 쉽습니다. 전기형성과 반대로, 역에멀젼 방법은 다양한 농도의 다양한 분자 조합을 캡슐화할 수 있습니다. 게다가, 원래의 도립 에멀젼 기술(25)과 비교하여, 이 접근법은 CFE 용해물 또는 PURE 시스템의 캡슐화에 적합한 보다 안정적인 GUV를 생성한다. 더 높은 GUV 안정성은 GUV 막(37)의 조성물에 이중블록 공중합체가 존재할 뿐만 아니라 계면이 지질 분자로 포화될 수 있도록 하는 유수 계면의 긴 배양에 기인합니다. 마지막으로, 미세유체역학 접근법과 달리, 여기에 제시된 프로토콜은 작은 채널과 튜브를 필요로 하지 않습니다. 따라서 CFE 반응은 조립되자마자 캡슐화할 수 있으며, 흐름 부족 및 막힘 가능성으로 인한 GUV 조립 시간이 짧기 때문에 CFE 반응의 조기 시작을 방지할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 막 단백질 발현을 입증하는 것은 PUREfrex 반응에만 국한되지만, 용해물 기반 박테리아 또는 포유류 CFE 시스템과 같은 사용 가능한 다양한 CFE 시스템을 사용하여 단백질을 합성하도록 이 방법을 확장할 수 있습니다.
여기에 제시된 접근 방식은 GUV 형성 공정의 오일 의존적 특성과 안정적인 GUV를 가지려는 의도로 인해 발생하는 제한 사항이 있습니다. 이 접근법은 일반적으로 계면 안정화와 높은 GUV 수율에 필요한 오일-물 계면의 긴 배양 시간으로 인해 cDICE 또는 미세유체역학과 같은 다른 방법에 비해 더 깁니다. 또한, 지질 조성은 주로 소량의 다른 지질 또는 블록 공중합체를 가진 POPC로 제한되는 반면, 전기형성과 같은 다른 방법은 물리적 및 화학적 특성이 상이한 지질의 혼입에 더 적합합니다. 이 방법의 GUV 멤브레인 조성은 CFE 수율을 극대화하기 위해 POPC와 PBD-PEO의 혼합물이지만 GUV 멤브레인 조성의 가능한 변형을 테스트할 수 있습니다. 그러나 다른 멤브레인 단백질에 대해 파라미터의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 액적 유화는 수동 피펫팅을 통해 발생하기 때문에 이 방법을 통해 생성된 GUV는 다분산이며 크기가 매우 이질적입니다. 또한, 지질이 유기 단계에서 용해된다는 사실은 때때로 GUV 멤브레인의 두 엽단 사이에 기름 층을 일으키거나 이미징 챔버를 이미지 품질에 해로울 수 있는 기름으로 오염시킬 수 있습니다. 잔류 오일 문제에 대한 가능한 해결 방법은 Tsumoto et al.38에서 보여준 것처럼 미네랄 오일을 디에틸 에테르와 같은 휘발성 유기 용매로 대체하여 GUV 형성 중 원심분리와 함께 용매 증발에 의존하는 것입니다.
이 작업에서는 채널 기능에 대한 시연이 없지만, 재구성된 기계 또는 빛에 민감한 채널 기능을 프로빙하는 데 사용된 이전 분석에서 영감을 받아 형광 현미경 기반 분석이 간략하게 설명되어 있습니다. GluR0 채널의 개방은 K+ 이온24에 대한 막 전도도를 증가시키는 것으로 보고되었습니다. CFE 반응에는 이미 고농도의 K+가 포함되어 있기 때문에 일반적인 칼륨 지시약은 채널 기능을 평가하는 데 적합하지 않습니다. 그러나 칼륨 유입이 막 전위를 변화시키기 때문에 DiBAC4(3)22 또는 BeRST 139 와 같은 민감한 막 전위 지표는 글루타메이트가 있는 상태에서 GluR0 활성을 보고할 수 있습니다.
합성 세포에서 막 단백질의 성공적인 재구성은 자연 세포를 보다 밀접하게 모방하는 전례 없는 능력을 가진 합성 세포를 만들 수 있는 수많은 가능성을 열어줍니다. 현재 합성 전지의 가장 큰 단점은 에너지를 재생하고 재활용할 수 없다는 것입니다. 그러나, 막 단백질에 크게 의존하는 빛과 화학물질에 의존하는 에너지 재생 계획을 통해, 오래 지속되는 합성 세포(40)를 상상할 수 있다. CFE 시스템을 활용하면 특정 작업을 집합적으로 수행할 수 있는 여러 막 단백질을 재구성할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에 설명된 GluR0와 유사한 리간드 개폐 이온 채널의 재구성은 다른 전압 개폐 이온 채널과 함께 여기성 뉴런과 같은 합성 세포의 구축으로 이어질 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
APL은 미국 국립과학재단(National Science Foundation, EF1935265), 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01-EB030031 및 R21-AR080363), 육군 연구실(Army Research Office, 80523-BB)의 지원을 인정합니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
| 96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
| Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
| Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
| Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
| Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
| PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
| pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
| PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
| Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
| Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
| VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |
References
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