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Bioengineering

Ricostituzione del canale del recettore del glutammato batterico mediante incapsulamento di un sistema di espressione libero da cellule

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66595
Automatic Translation
*1,2, *3, 2,3,4,5
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive il metodo dell'emulsione invertita utilizzato per incapsulare un sistema di espressione libera da cellule (CFE) all'interno di una vescicola unilamellare gigante (GUV) per lo studio della sintesi e dell'incorporazione di una proteina modello di membrana nel doppio strato lipidico.

Abstract

I sistemi di espressione libera cellulare (CFE) sono potenti strumenti nella biologia sintetica che consentono la biomimetica di funzioni cellulari come il biorilevamento e la rigenerazione di energia nelle cellule sintetiche. La ricostruzione di un'ampia gamma di processi cellulari, tuttavia, richiede la ricostituzione di successo delle proteine di membrana nella membrana delle cellule sintetiche. Mentre l'espressione di proteine solubili è solitamente efficace nei comuni sistemi CFE, la ricostituzione delle proteine di membrana nei doppi strati lipidici delle cellule sintetiche si è dimostrata impegnativa. Qui, viene dimostrato un metodo per la ricostituzione di una proteina modello di membrana, il recettore batterico del glutammato (GluR0), in vescicole unilamellari giganti (GUV) come cellule sintetiche modello basate sull'incapsulamento e l'incubazione della reazione CFE all'interno di cellule sintetiche. Utilizzando questa piattaforma, è stato dimostrato l'effetto della sostituzione del peptide segnale N-terminale di GluR0 con il peptide segnale della proteorhodopsina sulla traslocazione cotraduzionale di GluR0 nelle membrane di GUV ibridi. Questo metodo fornisce una procedura robusta che consentirà la ricostituzione senza cellule di varie proteine di membrana in cellule sintetiche.

Introduction

La biologia sintetica dal basso verso l'alto ha guadagnato un crescente interesse nell'ultimo decennio come campo emergente con numerose potenziali applicazioni nella bioingegneria, nella somministrazione di farmaci e nella medicina rigenerativa 1,2. Lo sviluppo di cellule sintetiche come pietra miliare della biologia sintetica bottom-up, in particolare, ha attratto un'ampia gamma di comunità scientifiche grazie alle promettenti applicazioni delle cellule sintetiche e alle loro proprietà fisiche e biochimiche simili a quelle cellulari che facilitano gli studi biofisici in vitro 3,4,5,6 . Le cellule sintetiche sono spesso ingegnerizzate in vescicole unilamellari giganti delle dimensioni di una cellula (GUV) in cui vengono ricreati diversi processi biologici. La ricostituzione del citoscheletro cellulare 7,8, la rigenerazione dell'energia dipendente dalla luce9, la comunicazione cellulare10,11 e il biosensing12 sono esempi di sforzi compiuti per ricostruire comportamenti simili a cellule nelle cellule sintetiche.

Mentre alcuni processi cellulari si basano su proteine solubili, molte caratteristiche delle cellule naturali, come il rilevamento e la comunicazione, spesso utilizzano proteine di membrana, inclusi canali ionici, recettori e trasportatori. Una delle principali sfide nello sviluppo delle cellule sintetiche è la ricostituzione delle proteine di membrana. Sebbene i metodi tradizionali di ricostituzione delle proteine di membrana nei doppi strati lipidici si basino sulla purificazione mediata da detergenti, tali metodi sono laboriosi, inefficaci per le proteine che sono tossiche per l'ospite di espressione, o spesso non sono adatti per la ricostituzione delle proteine di membrana nei GUVs13.

Un metodo alternativo per l'espressione proteica sono i sistemi di espressione libera da cellule (CFE). I sistemi CFE sono stati un potente strumento nella biologia sintetica che consente l'espressione in vitro di varie proteine utilizzando lisato cellulare o macchinari di trascrizione-traduzione purificati14. I sistemi CFE possono anche essere incapsulati in GUV, consentendo così reazioni di sintesi proteica compartimentate che possono essere programmate per varie applicazioni, come la creazione di cellule sintetiche che raccolgono la luce9 o biosensori meccanosensibili15,16. Analogamente ai metodi di espressione delle proteine ricombinanti, l'espressione delle proteine di membrana è impegnativa nei sistemi CFE17. L'aggregazione, il ripiegamento errato e la mancanza di modificazioni post-traduzionali nei sistemi CFE sono i principali colli di bottiglia che ostacolano il successo della sintesi proteica di membrana utilizzando i sistemi CFE. La difficoltà della ricostituzione delle proteine di membrana dal basso verso l'alto utilizzando sistemi CFE è dovuta in parte all'assenza di una complessa via di biogenesi delle proteine di membrana che si basa su peptidi segnale, particelle di riconoscimento del segnale, transloconi e molecole chaperoning. Tuttavia, recentemente, diversi studi hanno suggerito che la presenza di strutture membranose come microsomi o liposomi durante la traduzione promuove il successo dell'espressione delle proteine di membrana 18,19,20,21. Inoltre, Eaglesfield et al. e Steinküher et al. hanno scoperto che l'inclusione di specifici domini idrofobici noti come peptidi segnale nell'N-terminale della proteina di membrana può migliorare significativamente la sua espressione22,23. Nel complesso, questi studi suggeriscono che la sfida della ricostituzione delle proteine di membrana nelle cellule sintetiche può essere superata se la traduzione proteica avviene in presenza della membrana GUV e se viene utilizzato un peptide segnale N-terminale appropriato.

Qui viene presentato un protocollo per l'incapsulamento della sintesi proteica utilizzando reazioni CFE con elementi ricombinanti (PURE) per la ricostituzione delle proteine di membrana nei GUV. Il recettore batterico del glutammato24 (GluR0) è stato selezionato come proteina modello di membrana e ha studiato l'effetto del suo peptide segnale N-terminale sulla sua ricostituzione di membrana. L'effetto del peptide segnale della proteorodopsina, che ha dimostrato di migliorare l'efficienza della ricostituzione delle proteine di membrana da Eaglesfield et al.22, è studiato costruendo una variante mutata di GluR0 indicata come PRSP-GluR0 e la sua espressione e localizzazione di membrana con GluR0 wild-type (indicato come WT-GluR0 di seguito) che ospita il suo peptide segnale nativo. Questo protocollo si basa sul metodo dell'emulsione invertita25 con modifiche che lo rendono robusto per l'incapsulamento CFE. Nel metodo presentato, le reazioni CFE vengono prima emulsionate utilizzando una soluzione di lipidi in olio che genera goccioline di dimensioni micron che contengono il sistema CFE e sono stabilizzate dal monostrato lipidico. Le goccioline di emulsione vengono quindi stratificate sopra un'interfaccia olio-acqua che è satura di un altro monostrato lipidico. Le goccioline di emulsione sono quindi costrette a viaggiare attraverso l'interfaccia olio-acqua tramite la forza centrifuga. Attraverso questo processo, le goccioline ottengono un altro monostrato, generando così una vescicola lipidica a doppio strato. I GUV contenenti la reazione CFE vengono quindi incubati, durante i quali la proteina di membrana viene espressa e incorporata nella membrana GUV. Sebbene questo protocollo sia specificato per l'espressione libera da cellule di GluR0, può essere utilizzato per la sintesi libera da cellule di altre proteine di membrana o per diverse applicazioni cellulari sintetiche come la ricostituzione del citoscheletro o gli studi di fusione di membrana26.

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Protocol

I reagenti e le attrezzature utilizzate per questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Reazioni di massa di CFE in presenza di piccole vescicole unilamellari (SUV)

  1. Preparazione SUV
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo le istruzioni di sicurezza per lavorare con il cloroformio.
    1. Preparare 5 mM di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) SUV in un flaconcino di vetro trasferendo 76 μL di soluzione madre POPC 25 mg/mL disciolta in cloroformio.
    2. Ruotando delicatamente la fiala di vetro, soffiare un leggero flusso di argon nella fiala per formare una pellicola di lipidi secchi sul fondo. Quindi, trasferire la fiala di vetro in un essiccatore con il tappo avvitato in modo lasco per far evaporare il cloroformio in eccesso.
    3. Conservare il flaconcino di vetro nell'essiccatore per 1 ora. Quindi, aggiungere 0,5 ml di acqua deionizzata ultrapura per sciogliere il film lipidico e vorticare per circa 2 minuti.
    4. Installare un apparato di miniestrusione immergendo due supporti filtranti in acqua deionizzata e posizionandoli su ciascuno dei supporti interni della membrana. Quindi, immergere un filtro in policarbonato da 100 nm e posizionarlo tra i due supporti membrana interni tenuti insieme dall'involucro esterno dell'estrusore e dal dado di ritegno. Posiziona questa configurazione nel supporto dell'estrusore.
    5. Sciacquare due siringhe a tenuta di gas da 1 ml 3 volte con acqua deionizzata ultrapura.
    6. Caricare il campione di miscela lipidico-acqua in una delle siringhe a tenuta di gas da 1 ml e posizionarlo in un'estremità del mini estrusore utilizzando le clip a braccio oscillante per tenere la siringa in posizione. Inserisci la seconda siringa nell'altra estremità del mini-estrusore e assicurati che sia completamente premuta.
      NOTA: Quando si carica la siringa con la miscela di lipidi e acqua, assicurarsi che non ci sia aria nella siringa prima di farla passare attraverso il mini-estrusore.
    7. Passare delicatamente la miscela di acqua e lipidi dalla siringa originale alla siringa vuota attraverso l'apparato del mini-estrusore. Ripeti questo passaggio 11 volte per formare i SUV. Trasferire i SUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: La soluzione SUV può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  2. Assemblaggio di reazione CFE
    1. Assemblare la reazione CFE seguendo il protocollo di espressione libera da cellule fornito dal produttore con lievi modifiche descritte di seguito.
    2. Miscelare 10 μl di soluzione 1 (contenente amminoacidi, NTP, tRNA e substrati per enzimi e tampone necessario), 1 μl di soluzione 2 (proteine in glicerolo al 20%), 2 μl di soluzione 3 (ribosoma (20 μM)), una quantità appropriata di DNA che codifica per sfGFP-sfCherry(1-10)27 solubile (di seguito denominato sfGFP solubile), WT-GluR0-sfGFP o PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 coppie di basi), 1 μL di inibitore dell'RNAsi murina e 4 μL di soluzione SUV da 5 mM per le proteine di membrana o 4 μL di acqua per le proteine solubili.
    3. Portare il volume finale della reazione a 20 μl aggiungendo acqua deionizzata ultrapura.
      NOTA: Durante il montaggio del sistema CFE, tutti i componenti devono essere tenuti in ghiaccio. Tutti i materiali sono sensibili alla temperatura e possono degradarsi se raggiungono la temperatura ambiente.
  3. Incubazione e monitoraggio della reazione CFE
    1. Trasferire la soluzione CFE in una piastra conica a fondo V a 96 pozzetti. Per evitare l'evaporazione durante il corso della reazione, coprire la piastra con una pellicola sigillante.
    2. Incubare la piastra a 37 °C in un lettore di piastre per 4-5 ore mentre si monitora la reazione CFE misurando il segnale GFP con un guadagno di 100 a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488 nm/528 nm ogni 2 minuti.

2. Reazioni CFE incapsulate in GUV

  1. Preparazione della soluzione tampone esterna GUV
    1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, miscelare 1,5 μL di spermidina 1 M, 37,5 μL di ATP 100 mM, 25 μL di 100 mM GTP, 12,5 μL di 100 mM CTP, 12,5 μL di 100 mM UTP, 25 μL di 1 M di creatina fosfato, 18 μL di acetato di magnesio 1 M, 93,33 μL di glutammato di potassio 3 M, 50 μL di 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL di acido folinico 332 mM, 100 μL di glucosio 2 M e 50 μL dalla soluzione madre di una miscela di 6 mM di ciascuno dei 20 amminoacidi (preparata seguendo il protocollo descritto da Sun et al.28).
    2. Portare il volume finale della soluzione a 1 ml aggiungendo acqua deionizzata ultra-purificata.
      NOTA: Tutti i componenti devono essere tenuti in ghiaccio. Aggiungere la miscela di aminoacidi alla fine per evitare l'esaurimento degli aminoacidi28. La soluzione può essere aliquotata in aliquote da 330 μL e conservata a -20 °C fino al momento dell'uso.
  2. Preparazione della miscela lipidica in olio
    NOTA: questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo le istruzioni di sicurezza per lavorare con il cloroformio.
    1. In una cappa aspirante, miscelare 17,3 μL di soluzione madre POPC da 25 mg/mL e 1,08 μL di copolimero poli(butadiene)-b-poli(ossido di etilene) (PEO-b-PBD) da 50 mg/mL in un flaconcino di vetro da 15 mL.
      NOTA: La soluzione finale di lipidi in olio contiene 0,5 mM di lipidi con il 95% e il 5% di POPC e PEO-b-PBD, rispettivamente. La PEO-b-PBD è stata utilizzata per migliorare la stabilità della membrana durante l'espressione proteica, ma è stata mantenuta a un basso rapporto molare per ridurre la tendenza del copolimero ad aggregarsi in micelle separate dalle molecole lipidiche29,30.
    2. Soffiare con cautela un leggero flusso di gas argon nella fiala di vetro mentre si ruota la fiala per far evaporare il cloroformio.
    3. Pipettare 1,2 mL di olio minerale leggero nella fiala di vetro da 15 mL contenente i lipidi essiccati.
    4. Mescolare i lipidi e l'olio agitando alla massima velocità per 10-20 s. La miscela lipidico-copolimero disciolta apparirà torbida.
    5. Per garantire che tutti i possibili aggregati lipidici nell'olio siano completamente disciolti e dispersi in tutto l'olio, porre la fiala di vetro in un forno a circa 50 °C per 20 minuti prima di agitare per altri 10-20 s alla massima velocità.
  3. Assemblaggio e incapsulamento della reazione CFE (la Figura 1 riassume i seguenti passaggi).
    1. Preparare 300 μl della soluzione esterna GUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL mescolando 270 μl di soluzione tampone esterna CFE preparata nella fase 2.1, 15 μl di NaCl 5 M e 15 μl di KCl 4,5 M.
      NOTA: A questo punto, aggiungere 0,45 μl di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT) alla soluzione esterna GUV. Lo scopo dell'aggiunta di NaCl e KCl è quello di regolare l'osmolalità della soluzione esterna in modo che corrisponda alla soluzione interna di CFE. Il volume esatto di NaCl e KCl dipende dalla regolazione dell'osmolalità desiderata. Si può aggiungere NaCl o KCl o entrambi per regolare l'osmolalità.
    2. Pipettare delicatamente 300 μL di miscela di lipidi in olio sopra la soluzione esterna GUV.
      NOTA: Quando si aggiunge la miscela di olio lipidico, è importante che l'olio non si mescoli con la soluzione acquosa esterna. Dopo l'aggiunta, dovrebbe esserci un'interfaccia visibile tra la miscela di lipidi in olio e la soluzione esterna di GUV.
    3. Incubare l'interfaccia olio-acqua a temperatura ambiente per 2 ore per consentire al monostrato lipidico di formarsi e stabilizzarsi all'interfaccia.
    4. Nel frattempo, seguire la sezione 1.2.1 per assemblare una reazione CFE contenente il DNA plasmidico che codifica per le varianti proteiche di membrana o GFP solubile. Sostituire i 4 μl di soluzione SUV da 5 mM o l'acqua con 4 μl di saccarosio 1 M. Questa reazione sarà la soluzione interna del GUV.
      NOTA: Un osmometro è stato utilizzato per misurare l'osmolalità delle soluzioni interne ed esterne. L'osmolalità della soluzione esterna è stata quindi regolata di conseguenza mediante l'aggiunta di NaCl o acqua. L'osmolalità della reazione CFE è tipicamente di circa 1600 mOsm/Kg. L'aggiunta di saccarosio alla reazione aumenta la densità interna della soluzione, consentendo così alle vescicole di viaggiare attraverso l'interfaccia olio-acqua durante la fase di centrifugazione. Un'alternativa al saccarosio è la soluzione a gradiente di densità Opti-Prep.
    5. Aggiungere 600 μl di miscela di lipidi e oli alla provetta per microcentrifuga contenente la reazione CFE e pipettare su e giù energicamente per ~1 min per emulsionare la reazione in soluzione di lipidi in olio e formare il monostrato lipidico attorno alle cellule sintetiche.
      NOTA: La soluzione finale non deve avere bolle e deve apparire opaca.
    6. Pipettare delicatamente l'emulsione della soluzione interna sopra lo strato di olio nella provetta per microcentrifuga da 1,5 ml in cui è stata impostata l'interfaccia olio-acqua.
      NOTA: Fare attenzione a non disturbare o destabilizzare l'interfaccia.
    7. Centrifugare per 10 minuti a 2.000 x g a 4 °C.
      NOTA: La velocità di centrifugazione è stata ottimizzata per questo protocollo. Adir et al.31 hanno riportato una diversa velocità di centrifugazione.
    8. Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere con cura l'olio in eccesso e la soluzione esterna dalla provetta della microcentrifuga utilizzando un pipettatore. Rimuovere la soluzione esterna fino a quando il volume rimanente è di circa 100 μL.
      NOTA: Un pellet di GUV è solitamente visibile sul fondo della provetta della microcentrifuga. Tuttavia, la mancanza di un pellet visibile non significa necessariamente che non ci sia resa in GUV. Invece di utilizzare un pipettatore, l'olio in eccesso sopra la soluzione esterna può essere rimosso mediante aspirazione. È fondamentale assicurarsi che la soluzione lipidica in olio sia completamente rimossa. La contaminazione da olio nella soluzione GUV può causare immagini di bassa qualità.
    9. Risospendere il pellet GUV nella soluzione rimanente da 100 μl pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso. Quindi, trasferire la soluzione GUV in una piastra a fondo piatto pulita e trasparente da 96 pozzetti per incubare.

3. Incubazione e imaging della reazione CFE incapsulata

  1. Coprire la piastra con una pellicola sigillante per evitare l'evaporazione. Incubare la piastra a 37 °C per 5-6 ore. È possibile utilizzare un lettore di piastre e seguire il passaggio 1.3.2 per preparare il lettore di piastre per la fase di incubazione.
  2. Una volta terminata l'incubazione, posizionare la piastra a 96 pozzetti sul tavolino di imaging di un microscopio invertito dotato di una fotocamera EMCCD (o una fotocamera sCMOS), un laser controllato DAQ-MX (o un sistema di combinazione laser integrato) e un confocale a disco rotante CSU-X1 (o un confocale a scansione laser). Concentrati su qualsiasi ROI contenente GUV e acquisisci immagini a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm utilizzando un obiettivo Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.
  3. Salva le immagini dei GUV in formato .tiff.
  4. Aprire le immagini in un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, ImageJ o Fiji). Aprire il pannello delle impostazioni Luminosità/Contrasto . Regola la luminosità e il contrasto su impostazioni appropriate che rendano visibili le proteine fluorescenti.
  5. Se l'obiettivo è confrontare l'intensità del segnale di diverse proteine espresse, per prima cosa impila singole immagini di GUV contenenti proteine diverse utilizzando il pannello Immagini da impilare situato nel sottomenu Immagine > Impila. Quindi, regolare la luminosità e il contrasto di tutte le immagini utilizzando il pannello Luminosità/Contrasto .

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Representative Results

Prima dell'incapsulamento delle reazioni CFE, due varianti di GluR0-sfGFP che ospitano peptidi segnale nativi e proteorhodopsina (le sequenze di peptidi segnale sono presentate nella Tabella supplementare 1) e la sfGFP solubile sono state espresse individualmente in reazioni di massa e la loro espressione è stata monitorata rilevando il segnale sfGFP utilizzando un lettore di piastre (Figura 2A). Le proteine di membrana sono state espresse in assenza o presenza di SUV a 100 nm. Inoltre, utilizzando una curva di calibrazione che correla il segnale sfGFP alla sua concentrazione (Figura 1 supplementare), sono state stimate le concentrazioni di proteine sintetizzate (Tabella 2 supplementare). Chiaramente, la sfGFP solubile aveva la più alta espressione tra tutte e tre le proteine, il che suggerisce che l'espressione delle proteine di membrana impone un carico sul sistema CFE, rallentando così la reazione e abbassandone la resa. Inoltre, in media, le reazioni che esprimono proteine di membrana in presenza di SUV hanno mostrato un segnale sfGFP più elevato rispetto alle reazioni prive di SUV. Questa osservazione si allinea con i risultati di Steinküher et al., che hanno dimostrato che l'espressione delle proteine di membrana riduce la capacità dei sistemi CFE di produrre proteine23. Tuttavia, data la dimostrazione di successo dell'espressione proteica nella reazione di massa della CFE, si può pensare che la CFE incapsulata sintetizzerà anche proteine all'interno delle GUV.

Successivamente, le singole reazioni CFE sono state incapsulate in GUV utilizzando il metodo dell'emulsione invertita per esprimere varianti di GluR0, vale a dire WT-GluR0, PRSP-GluR0 e sfGFP solubile. Mentre WT-GluR0, che ospita il peptide del segnale nativo di GluR0, ha dimostrato un'eccellente espressione e localizzazione di membrana (Figura 2B, pannello a sinistra), la sua controparte, PRSP-GluR0, che ha il peptide del segnale N-terminale della proteorodopsina, non ha mostrato una forte localizzazione di membrana simile. È stato riscontrato che PRSP-GluR0 è più incline all'aggregazione e alla formazione di punteggi (Figura 2B, pannello centrale). Come previsto, la sfGFP solubile era espressa nei GUV e rimaneva nel lume dei GUV (Figura 2B, pannello a destra; vedere la Figura 2 supplementare per le immagini delle coorti di GUV).

Figure 1
Figura 1: Fasi sperimentali dell'emulsione invertita. (1) I passaggi da 2.3.1 a 2.3.3 del protocollo sono visualizzati per dimostrare l'assemblaggio del monostrato lipidico all'interfaccia della miscela lipidico-olio e della soluzione tampone esterna. (2) La visualizzazione del passaggio 2.3.5 del protocollo è mostrata qui per rappresentare la formazione del monostrato lipidico attorno alle goccioline emulsionate che incapsulano la soluzione interna di CFE. (3) La fase 2.3.6 del protocollo mostra l'aggiunta dei GUV monostrato alla provetta per microcentrifuga con il monostrato lipidico all'interfaccia di una miscela di lipidi-olio e di una soluzione tampone esterna. (4) Qui è illustrato il passaggio 2.3.7, in cui la centrifugazione porta alla formazione di un pellet GUV nella soluzione esterna. (5) Qui è mostrato il passaggio 2.3.8, che indica il processo di rimozione della miscela di lipidi in olio in eccesso e della soluzione esterna. (6) Infine, qui è raffigurato il passaggio 2.3.9, in cui il pellet di GUV viene risospeso nella soluzione esterna e i GUV sono pronti per l'incubazione, seguita dall'imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Espressione proteica nelle reazioni di CFE di massa e nelle GUV che incapsulano le reazioni di CFE. (A) Letture in fluorescenza di singole reazioni di CFE di massa che esprimono WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP e sfGFP solubile. Il grafico sfGFP solubile rappresenta il segnale di una reazione da 2,5 μL (il volume di reazione standard è 20 μL) per evitare la sovrasaturazione delle misure del lettore di piastre. I dati sono presentati come media ± S.D, n = 3. (B) A sinistra: Un'immagine confocale rappresentativa di una reazione CFE incapsulante GUV che esprime WT-GluR0-sfGFP. Al centro: un'immagine confocale rappresentativa di GUVs che incapsulano la reazione CFE che esprime PRSP-GluR0-sfGFP. A destra: un'immagine confocale rappresentativa di una reazione CFE incapsulante GUV che esprime sfGFP solubile. Barre di scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: La curva di calibrazione del segnale sfGFP e la corrispondente analisi di regressione lineare. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Immagine confocale rappresentativa di coorti di GUV che esprimono (a sinistra) WT-GluR0-sfGFP, (al centro) PRSP-GluR0-sfGFP e (a destra) sfGFP solubile. Barra di scala: 10 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: La sequenza aminoacidica dei peptidi segnale wild-type e proteorhodopsine. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: La concentrazione di proteine sintetizzate nelle reazioni di massa CFE. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Praticamente qualsiasi processo cellulare che dipende dal trasferimento di molecole o informazioni attraverso la membrana cellulare, come la segnalazione cellulare o l'eccitazione cellulare, richiede proteine di membrana. Pertanto, la ricostituzione delle proteine di membrana è diventata il principale collo di bottiglia nella realizzazione di vari progetti di cellule sintetiche per diverse applicazioni. La tradizionale ricostituzione mediata da detergenti delle proteine di membrana nelle membrane biologiche richiede metodi di generazione di GUV come il rigonfiamento delicato o l'elettroformazione. Gli approcci di rigonfiamento di solito producono vescicole di piccole dimensioni e la resa dell'elettroformazione diminuisce significativamente quando vengono incapsulate soluzioni complicate, che è spesso il caso quando si generano cellule sintetiche32. Inoltre, i detergenti solubilizzano la proteina di membrana e la loro rimozione durante il processo di ricostituzione può causare un misfolding delle proteine33,34. D'altra parte, l'approccio qui presentato si basa sull'incorporazione cotraslazionale della proteina di membrana nel doppio strato lipidico, che assomiglia di più alla via naturale della biogenesi proteica nelle cellule22.

Da un punto di vista tecnico, il protocollo presentato è vantaggioso rispetto ad altri metodi di incapsulamento comuni, come l'elettroformazione e l'incapsulamento continuo dell'incrocio dell'interfaccia delle gocce 7,8,35,36 (cDICE), per una più facile implementazione in quanto l'unica attrezzatura di laboratorio richiesta per la generazione di GUV è una centrifuga. A differenza dell'elettroformazione, il metodo dell'emulsione invertita consente l'incapsulamento di diverse combinazioni di molecole con varie concentrazioni. Inoltre, rispetto alla tecnica originale dell'emulsione invertita25, questo approccio genera GUV più stabili che sono adatti per l'incapsulamento di lisati CFE o sistemi PURE. La maggiore stabilità dei GUV è dovuta alla presenza di un copolimero diblocco nella composizione della membranaGUV 37 e alla lunga incubazione dell'interfaccia olio-acqua che permette di saturare l'interfaccia con molecole lipidiche. Infine, a differenza degli approcci microfluidici, il protocollo qui presentato non richiede canali e tubi di piccole dimensioni. Pertanto, la reazione CFE può essere incapsulata non appena viene assemblata e il tempo più breve di assemblaggio del GUV a causa della mancanza di flusso e del possibile intasamento impedisce l'avvio prematuro della reazione CFE. Sebbene la dimostrazione dell'espressione proteica di membrana in questo protocollo sia esclusiva delle reazioni PUREfrex, è possibile estendere questo metodo per sintetizzare proteine utilizzando diversi sistemi CFE disponibili, come i sistemi CFE batterici o di mammifero basati sul lisato.

L'approccio qui presentato ha dei limiti che sono causati dalla natura dipendente dal petrolio del processo di formazione dei GUV e dall'intento di avere GUV stabili. Questo approccio è in genere più lungo rispetto ad altri metodi, come cDICE o la microfluidica, a causa del lungo tempo di incubazione dell'interfaccia olio-acqua necessario per la stabilizzazione dell'interfaccia e l'elevata resa GUV. Inoltre, la composizione lipidica è principalmente limitata al POPC con piccole dosi di altri lipidi o copolimeri a blocchi, mentre altri metodi, come l'elettroformazione, sono più adatti per l'incorporazione di lipidi con diverse proprietà fisiche e chimiche. Mentre la composizione della membrana GUV in questo metodo è una miscela di POPC e PBD-PEO per massimizzare la resa CFE, è possibile testare possibili variazioni nella composizione della membrana GUV. Tuttavia, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione dei parametri per altre proteine di membrana. Poiché l'emulsione delle goccioline avviene attraverso il pipettaggio manuale, i GUV generati con questo metodo sono polidispersi e di dimensioni piuttosto eterogenee. Inoltre, il fatto che i lipidi siano disciolti nella fase organica può occasionalmente causare uno strato di olio tra i due lembi della membrana GUV o contaminare la camera di imaging con olio che può essere dannoso per la qualità dell'immagine. Una possibile soluzione alternativa per la sfida dell'olio residuo è quella di sostituire l'olio minerale con un solvente organico volatile, come l'etere etilico, come dimostrato da Tsumoto et al.38, per fare affidamento sull'evaporazione del solvente insieme alla centrifugazione durante la formazione di GUV.

Sebbene non vi sia alcuna dimostrazione della funzione del canale in questo lavoro, ispirato da precedenti saggi utilizzati per sondare la funzionalità del canale meccanosensibile o alla luce ricostituita, viene delineato un saggio basato sulla microscopia a fluorescenza. Si dice che l'apertura del canale GluR0 aumenti la conducibilità della membrana per gli ioni K+ 24. Poiché le reazioni CFE contengono già un'alta concentrazione di K+, gli indicatori tipici del potassio non saranno adatti per valutare la funzionalità del canale. Tuttavia, poiché l'afflusso di potassio modifica il potenziale di membrana, indicatori sensibili del potenziale di membrana come DiBAC4(3)22 o BeRST 139 potrebbero riportare l'attività di GluR0 in presenza di glutammato.

Il successo della ricostituzione delle proteine di membrana nelle cellule sintetiche apre numerose possibilità per la creazione di cellule sintetiche con capacità senza precedenti che imitano più da vicino le cellule naturali. Uno dei principali svantaggi attuali delle celle sintetiche è la loro incapacità di riprodurre e riciclare l'energia. Tuttavia, con schemi di rigenerazione dell'energia dipendenti dalla luce e dalla sostanza chimica che si basano fortemente sulle proteine di membrana, si possono prevedere cellule sintetiche di lunga durata40. L'utilizzo di sistemi CFE consente la ricostituzione di più proteine di membrana che possono svolgere collettivamente determinati compiti. Ad esempio, la ricostituzione di un canale ionico ligando-dipendente simile a GluR0 qui descritto, insieme a diversi canali ionici voltaggio-dipendenti, può portare alla costruzione di una cellula sintetica eccitabile simile a un neurone.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgments

L'APL riconosce il sostegno della National Science Foundation (EF1935265), del National Institutes of Health (R01-EB030031 e R21-AR080363) e dell'Army Research Office (80523-BB)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 nm polycarbonate filter STERLITECH 1270193
96 Well Clear Bottom Plate ThermoFisher Scientific 165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader Agilent 11-120-533
Creatine phosphate Millipore Sigma 10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit Yokogawa CSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep) Millipore Sigma D1556 Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports Avanti 610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrate Millipore Sigma F7878
Glucose Millipore Sigma 158968
HEPES Millipore Sigma H3375
iXon X3 camera  Andor DU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1501
Light mineral oil Millipore Sigma M5904
Magnesium acetate tetrahydrate  Millipore Sigma M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) Avanti 610020
Olympus IX81 Inverted Microscope  Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective  Olympus 1-U2B933 
PEO-b-PBD Polymer Source P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
POPC lipid in chloroform  Avanti 850457C
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
PUREfrex 2.0 Cosmo Bio USA GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set New England BioLabs N0450
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs M0314S
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride Millipore Sigma S9888
Spermidine Millipore Sigma S2626
Sucrose Millipore Sigma S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 ELITechGroup VAPRO 5600

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References

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Parole chiave: Espressione libera da cellule Ricostituzione delle proteine di membrana Recettore del glutammato Vescicole unilamellari giganti Peptide segnale della proteorodopsina Cellule sintetiche
Ricostituzione del canale del recettore del glutammato batterico mediante incapsulamento di un sistema di espressione libero da cellule
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Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System. J. Vis. Exp. (205), e66595, doi:10.3791/66595 (2024).

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