Overview
这段视频描述了将癌症干细胞从乳腺癌细胞系中分离而来。我们培养这些癌症干细胞，以产生主要的乳腺层，用于评估自我更新和计算球体形成效率，允许不同种子密度的比较。
Protocol
1. 人类乳腺癌细胞系的原生乳腺细胞生成
注： 在无菌培养罩下执行以下步骤。
- 准备含有 DMEM/F12 的乳腺介质，辅以 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素。使用前立即准备完整的介质，添加 20 ng/ml 重组人类表皮生长因子 （EGF;西格玛），10 ng/ml重组人类基本成纤维细胞生长因子（bFGF：研发系统）和1x B27补充剂。
- 从含有附着MCF-7或MDA-MB-231细胞（或您选择的乳腺癌细胞系;70-80%汇合）的烧瓶中吸气介质，在1倍PBS中洗两次，并尝试对细胞进行分化。
- 离心细胞在室温下200 x g，温度为5分钟。在 1-5 毫升的乳腺层介质中解密超自然和补充细胞。Pipette 上下移动，如有必要，使用 40μm 细胞滤芯盖过滤器获得单细胞悬架。使用血细胞仪确保形成单个细胞悬架（如果没有，使用 25 G 针将细胞悬浮器注射多达 3 次）。
- 如有必要，使用抗CD24-植物素（PE）和抗CD44-荧光素异氰酸酯（FITC）单克隆抗体9，通过FACS分离CD44+CD24细胞子集。或者，根据制造商的说明，使用磁激活细胞分拣 （MACS） 系统与抗 CD44 和抗 CD24-生物素相结合的微珠分离此类人群。使用LS列进行正选择，使用LD列进行负选择，并通过流动细胞测量确认所有分离细胞的表型。
- 使用尝试盘蓝色计算每毫升可行细胞的数量。
注： 细胞生存能力按活性细胞的数量除以血细胞仪网格内的细胞总数来计算。占用三潘蓝的细胞被认为是不可行的。以下程序用于准确确定可行细胞的比例。- 在 PBS 中准备 0.4% 的尝试盘蓝色解决方案。将 0.1 毫升的试锅蓝色库存溶液添加到 1 毫升细胞中。加载造影仪，并立即在显微镜下以低倍率检查。计算总细胞的数量和蓝色染色细胞的数量。可行细胞=[1.00-（蓝细胞数量÷总细胞数）]×100。
- 要计算每毫升培养的可行细胞数量，请使用以下公式。请记住纠正稀释因子。
活细胞数量× 104 × 1.1 = 细胞/毫升培养
- 在 6 井超低粘附板的每口井中，在 2 毫升完整的乳腺层介质中恢复预先确定的细胞量。播种密度通常为每口井500-4，000个细胞/厘米2个细胞。可选使用低附件 24 井板，同时在 0.5 毫升介质中以相同密度播种细胞。
注： 我们建议优化每个感兴趣的细胞系的播种密度和培养时间。 - 在 37 °C 和 5% CO2的 5-10 天内（取决于细胞线和乳腺层大小）孵化超低附件 6 井板，而不会干扰板，尤其是在前 5 天的生长阶段。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 |
