Geração de Mammospheres Primários: Uma Técnica para Determinar a Potência Celular

Overview

Este vídeo descreve células-tronco de câncer isolando de linhas de células cancerígenas de mama. Nós culturalizamos essas células-tronco cancerígenas para gerar mammosféricas primárias para avaliar a autoconexão e calcular a eficiência da formação de esferas, permitindo a comparação entre diferentes densidades de semeadura.

Protocol

1. Geração de Mammospheres Primários de Linhas celulares de câncer de mama humano

NOTA: Execute os seguintes passos sob um capô de cultura estéril.

1. Prepare a mídia mamosfera contendo DMEM/F12 suplementada com 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 U/ml streptomicina. Prepare a mídia completa imediatamente antes do uso adicionando 20 ng/ml recombinante fator de crescimento epidérmico humano (EGF; Sigma), 10 ng/ml recombinante fator de crescimento do fibroblasto básico humano (bFGF; Sistemas de P&D) e 1x suplemento B27.
2. Aspirar a mídia de frasco contendo células mcf-7 ou MDA-MB-231 (ou uma linha de células cancerígenas de mama de sua escolha; 70-80% de confluência), lavar duas vezes em 1x PBS e células de trypsinize.
3. Células centrífugas a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. Decant supernasce e células resuspend em 1-5 ml de mídia mammosfera. Pipeta para cima e para baixo e, se necessário, use um filtro de tampa de tensão celular de 40 μm para obter suspensão unicelular. Use um hemótmetro para garantir que uma única suspensão celular tenha se formado (se não, use uma agulha de 25 G para seringa a suspensão da célula em até 3 vezes).
4. Se necessário isolar cd44+CD24- subconjunto celular via FACS usando anticorpos monoclonais anti-CD24-phycoerythrin (PE) e anti-CD44-fluoresceína (FITC) anticorpos monoclonais⁹. Alternativamente, isole essa população usando um sistema de classificação celular ativado por magnético (MACS) com microesferas combinadas anti-CD44 e anti-CD24-biotina, de acordo com as instruções do fabricante. Realize a seleção positiva usando colunas LS e seleção negativa usando colunas LD e confirme os fenótipos de todas as células isoladas por citometria de fluxo.
5. Calcule o número de células viáveis por ml usando azul trypan.
   NOTA: A viabilidade celular é calculada como o número de células viáveis divididas pelo número total de células dentro das grades do hemótmetro. Células que tomam azul trypan são consideradas inviáveis. O procedimento a seguir é usado para determinar com precisão a proporção de células viáveis.
   1. Prepare uma solução de 0,4% do trypan azul na PBS. Adicione 0,1 ml de solução de estoque azul trypan a 1 ml de células. Carregue um hemócito e examine imediatamente sob um microscópio em baixa ampliação. Conte o número de células totais e o número de células de coloração azul. Células viáveis = [1,00 – (Número de células azuis ÷ Número de células totais)] × 100.
   2. Para calcular o número de células viáveis por ml de cultura, use a fórmula abaixo. Lembre-se de corrigir para o fator de diluição.
      Número de células viáveis × 10⁴ × 1,1 = cultura celular/ml
6. Resuspenque uma quantidade pré-determinada de células em 2 ml de mídia completa da mamografia em cada poço de uma placa de 6 poços ultra-baixos. A densidade de semeadura é normalmente de 500-4.000 células/cm² células por poço. Opcionalmente, use placas de 24 poços de baixa fixação enquanto semeia células na mesma densidade em 0,5 ml de mídia.
   NOTA: Recomendamos a otimização da densidade de semeadura e tempo de cultura para cada célula de linhas de interesse.
7. Incubar placas de 6 poços de 6 poços de 37 °C e 5% de CO₂ por 5-10 dias (dependendo da linha celular e do tamanho de mammospheres) sem perturbar as placas, particularmente durante a fase de crescimento dos primeiros 5 dias.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814