Поколение первичных маммосфер: методика определения потенции клеток

Overview

Это видео описывает изоляцию раковых стволовых клеток от линий клеток рака молочной железы. Мы культурируем эти раковые стволовые клетки для генерации первичных маммосфер для оценки самообновления и расчета эффективности формирования сферы, что позволяет проводить сравнение по различным плотностям посева.

Protocol

1. Поколение первичных маммосфер из человеческих линий клеток рака молочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги под стерильным вытяжки культуры.

1. Приготовьте Mammosphere Media, содержащий DMEM/F12, дополненный 2 мМ Л-глутамином, 100 U/ml пенициллином, 100 U/ml стрептомицином. Подготовка полного средства массовой информации непосредственно перед использованием, добавив 20 нг/мл рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (EGF; Sigma), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробласта человека (bFGF; НИОКР систем) и 1x B27 дополнения.
2. Аспиратные средства из колбы, содержащие адепт MCF-7 или MDA-MB-231 клетки (или линии раковых клеток молочной железы по вашему выбору; 70-80% слияния), мыть дважды в 1x PBS, и трипсинировать клетки.
3. Клетки центрифуги при температуре 200 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Декант supernatant и resuspend клетки в 1-5 мл средств mammosphere. Pipette вверх и вниз, и при необходимости использовать 40 мкм ячейки ситечко крышка фильтра для получения одноклеточной подвески. Используйте гемоцитометр, чтобы обеспечить одноклеточную подвеску формируется (если нет, используйте 25 G иглы шприц подвески клетки до 3 раз).
4. При необходимости изолировать CD44-CD24- клеточной подмножество через FACS с использованием анти-CD24-фикоэритрона (PE) и анти-CD44-фторцеин изотиоцианат (FITC) моноклональные^{антитела 9}. Кроме того, изолировать такую популяцию с помощью магнитно-активированной системы сортировки клеток (MACS) с анти-CD44 и анти-CD24-биотин комбинированных микробусов в соответствии с инструкциями производителя. Выполните положительный отбор с помощью столбцов LS и отрицательного отбора с помощью столбцов LD и подтвердите фенотипы всех изолированных клеток по цитометрии потока.
5. Рассчитайте количество жизнеспособных ячеек на мл с помощью trypan blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток рассчитывается как количество жизнеспособных ячеек, разделенных на общее количество ячеек в сетках на гемоцитометре. Клетки, которые принимают трипан синий считаются не жизнеспособными. Следующая процедура используется для точного определения доли жизнеспособных клеток.
   1. Подготовка 0,4% решение trypan синий в PBS. Добавьте 0,1 мл трепанового раствора синего бульона в 1 мл клеток. Загрузите гемоцитометр и осмотрите сразу под микроскопом при низком увеличении. Подсчитайте количество клеток и количество синих окрашивающих клеток. Жизнеспособные клетки ( 1,00 - (Количество ÷ и количество общих ячеек)» × 100.
   2. Чтобы рассчитать количество жизнеспособных клеток на мл культуры, используйте формулу ниже. Не забудьте исправить фактор разбавления.
      Количество жизнеспособных клеток × 10⁴ × 1,1 - клетки/мл культуры
6. Повторное содержание заранее определенного количества клеток в 2 мл полных маммосферных средств массовой информации в каждом колодец 6-ну ультра-низкой адепт пластины. Плотность посева, как правило, 500-4000 клеток / см^{2 ячейки} на колодец. Опционально используйте пластины с низким вложением 24 хорошо, в то время как посевные клетки одинаковой плотности в 0,5 мл мультимедиа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем оптимизацию плотности посева и времени культуры для каждой линии клеток, представляющих интерес.
7. Инкубировать ультра низкой крепления 6-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию и 5% CO_{2 в} течение 5-10 дней (в зависимости от клеточной линии и размера маммосферы), не нарушая пластин, особенно во время фазы роста в течение первых 5 дней.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814