Generazione di mammosfere primarie: una tecnica per determinare la potenza cellulare

Overview

Questo video descrive l'isolamento delle cellule staminali tumorali dalle linee cellulari del cancro al seno. Coltimiamo queste cellule staminali tumorali per generare mammosfere primarie per valutare l'auto-rinnovamento e calcolare l'efficienza di formazione delle sfere, consentendo il confronto tra diverse densità di semina.

Protocol

1. Generazione di mammosfere primarie dalle linee cellulari del cancro al seno umano

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa di coltura sterile.

1. Preparare i supporti mammosfera contenenti DMEM/F12 integrati con 2 mM di L-glutammina, 100 U/ml di penicillina, 100 U/ml di streptomicina. Preparare il supporto completo immediatamente prima dell'uso aggiungendo 20 ng/ml di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (FEG; Sigma), fattore di crescita dei fibroblasti di base umano ricombinante da 10 ng/ml (bFGF; sistemi di ricerca e sviluppo) e 1 supplemento B27.
2. Aspirare i supporti dal pallone contenente cellule MCF-7 o MDA-MB-231 aderenti (o una linea cellulare per il cancro al seno di vostra scelta; confluenza del 70-80%, lavare due volte in 1 PBS e tripinare le cellule.
3. Centrifugare le cellule a 200 x g a temperatura ambiente per 5 minuti. Cellule decantanti e resuspend in 1-5 ml di mezzi mammosfera. Pipettare su e giù e, se necessario, utilizzare un filtro a cappuccio filtrante a celle da 40 μm per ottenere sospensioni a cella singola. Utilizzare un emocitometro per assicurarsi che si sia formata una singola sospensione cellulare (in caso meno, utilizzare un ago da 25 G per siringare la sospensione cellulare fino a 3 volte).
4. Se necessario isolare il sottoinsieme cellulare CD44+CD24- tramite FACS utilizzando anticorpi monoclonali anti-CD24-phycoerythrin (PE) e isotiocianato di fluoresceina anti-CD44-fluoresceina (FITC)⁹. In alternativa, isolare tale popolazione utilizzando un sistema macs (magnetic-activated cell sorting) con microperline combinate anti-CD44 e anti-CD24-biotina secondo le istruzioni del produttore. Eseguire una selezione positiva utilizzando colonne LS e una selezione negativa utilizzando colonne LD e confermare i fenotipi di tutte le celle isolate per citometria del flusso.
5. Calcolare il numero di celle vitali per ml utilizzando trypan blue.
   NOTA: La vitalità cellulare è calcolata come il numero di cellule vitali divise per il numero totale di cellule all'interno delle griglie sull'emocitometro. Le celle che prendono il blu tripano sono considerate non vitali. La seguente procedura viene utilizzata per determinare con precisione la proporzione di cellule vitali.
   1. Preparare una soluzione dello 0,4% di trypan blue in PBS. Aggiungere 0,1 ml di soluzione di stock blu di tripano a 1 ml di cellule. Caricare un emocitometro ed esaminare immediatamente al microscopio a basso ingrandimento. Contare il numero di celle totali e il numero di celle di colorazione blu. Celle vitali = [1,00 – (Numero di celle blu ÷ numero di celle totali)] × 100.
   2. Per calcolare il numero di cellule vitali per ml di coltura, utilizzare la formula seguente. Ricordarsi di correggere il fattore di diluizione.
      Numero di cellule vitali × 10⁴ × 1.1 = cellule/ml di coltura
6. Rimostrare una quantità predeterminata di cellule in 2 ml di mezzi mammosfera completi in ogni pozzo di una piastra aderente ultra-bassa a 6 po'. La densità di semina è normalmente di 500-4.000 cellule/cm² cellule per pozzo. Facoltativamente utilizzare piastre a basso attacco da 24 poggia-porsi durante la semina di cellule alla stessa densità in 0,5 ml di mezzi.
   NOTA: Si consiglia l'ottimizzazione della densità di semina e del tempo di coltura per ogni linea cellulare di interesse.
7. Incubare piastre ultra a basso attacco a 6 pozzi a 37 °C e 5% CO₂ per 5-10 giorni (a seconda della linea cellulare e delle dimensioni delle mammosfere) senza disturbare le piastre, in particolare durante la fase di crescita dei primi 5 giorni.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814