Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture
Summary
In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode om de invloed van de gliale cel heterogeniteit op axongroei studie met een<em> In vitro</em> Co-cultuur systeem. Rat corticale gliale cellen werden gekweekt tot confluentie en cocultured met zeer zuivere rat achterwortelganglia neuronen. Verschillende gliale cel invloed op de neuronen hechting en axongroei werd direct vergeleken in dezelfde cultuur. Deze methode biedt een nieuwe manier om direct de studie van de gliale cel heterogeniteit invloed op de hechting en neuron axon groei.
Abstract
In het centrale zenuwstelsel van alle zoogdieren, afgesneden axonen na verwonding niet in staat zijn te regenereren in hun oorspronkelijke doelen en functioneel herstel is zeer slecht 1. Het falen van regeneratie van axonen is een gecombineerde resultaat van verschillende factoren, waaronder de vijandige gliale cel omgeving, remmende myeline verwante moleculen en een verminderde intrinsieke neuron regeneratievermogen 2. Astrocyten zijn de meest overheersende gliale celtype in het centrale zenuwstelsel en spelen een belangrijke rol in het axon taken uit hoofde van fysiologie en pathologie voorwaarden 3. Tegenstelling tot de homologe oligodendrocyten, astrocyten zijn een heterogene celpopulatie samengesteld door verschillende astrocyten subpopulaties met verschillende morfologie en gen-expressie 4. De functionele betekenis van deze heterogeniteit, zoals hun invloeden op axon groei, is grotendeels onbekend.
De studie van de gliale cel, in het bijzonder de functie van astrocyte heterogeniteit in het gedrag van neuron, hebben we een nieuwe methode door de co-kweken van hoog gezuiverde achterwortelganglia neuronen met gliacellen verkregen uit de rat cortex. Door deze techniek konden we neuron hechting en axongroei direct vergelijken op verschillende subpopulaties astrocyten onder dezelfde voorwaarde.
In dit rapport geven we de gedetailleerde protocol van deze methode voor astrocyten isolatie en cultuur, achterwortelganglia neuronen isolatie en zuivering, en de co-cultuur van de DRG neuronen met astrocyten. Deze methode kan ook worden uitgebreid tot andere gebieden van de hersenen om de cellulaire of regionaal specifieke interactie tussen neuronen en gliacellen te bestuderen.
Protocol
Discussion
Dit experiment protocol is ontworpen om twee doelen te bereiken gliacellen, in het bijzonder astrocyten heterogeniteit van invloed op de neuron hechting en neurieten groei te bestuderen. Het eerste doel was om astrocyten heterogeniteit zoveel mogelijk, in dit experiment te houden, was de samenvloeiing gliale cel cultuur verrijkt astrocyten gemengde primaire cultuur zonder enige chemische behandeling en de spijsvertering voortplanting, die verder kan schade aan de cel en veroorzaken letsel reactie van astrocyten. De laat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door FMMU nieuwe vinding fundering en gedeeltelijk NIH financiering.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | ||
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | ||
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | ||
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
| poly-lysine | Sigma | P4832 | culture grade | |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | ||
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| FUDR | Sigma | F0503 | ||
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move?. J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
