चिकी भ्रूण में एकल सेल अभिकर्मक
Summary
ठीक टिप का उपयोग micropipettes हम चिकन somites या तंत्रिका ट्यूब की उपडोमेन में प्लास्मिड डीएनए इंजेक्षन. प्लाज्मिड की एकाग्रता एकल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए समायोजित किया गया है. हम तो कोशिकाओं clonal आबादी में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
विकास जीव विज्ञान में एक केंद्रीय विषय प्रजातियों के विविधीकरण और अंतर्निहित आणविक तंत्र की व्याख्या है. यह सामान्य और प्रयोगात्मक शर्तों के तहत एकल कक्षों के भाग्य का एक गहन विश्लेषण की जरूरत पर जोर देता है. यह अंत करने के लिए, अभिकर्मक तरीकों कि एकल progenitors लक्ष्य एक शर्त रहे हैं. हम यहाँ ओवो में चिकन ऊतकों में एकल कक्षों transfecting अनुमति आनुवंशिक हेरफेर के रूप में विश्वसनीय के रूप में अच्छी तरह से अनुरेखण वंश के लिए एक तकनीकी रूप से सरल तरीका वर्णन. विशिष्ट ऊतकों डोमेन somite या तंत्रिका ट्यूब के भीतर लक्षित कर रहे हैं, और डीएनए सीधे ब्याज की उपकला में अंतःक्षिप्त है, एकल कक्षों की छिटपुट अभिकर्मक में जिसके परिणामस्वरूप. संवाददाताओं का प्रयोग, clonal आबादी फलस्वरूप लिए पता लगाया जा सकता है तीन दिन के लिए, और आनुवंशिक छेड़छाड़ clonal आबादी के व्यवहार नियंत्रणों के साथ तुलना की जा सकती है. इस विधि लड़की भ्रूण की पहुंच के आनुवंशिक हेरफेर के लिए उभरते उपकरणों के साथ साथ लाभ लेता है. हम तुलना और व्यापक रूप से इस्तेमाल electroporation पद्धति पर अपने फायदे है, और संभव अनुप्रयोगों पर चर्चा और अतिरिक्त में vivo मॉडल में भी सुझाव दिया उपयोग . हम एक महत्वपूर्ण इसके अलावा और मौजूदा वंश अनुरेखण और आनुवंशिक हस्तक्षेप उपकरण के लिए पूरक के रूप में इस विधि का उपयोग समर्थन करते हैं.
Protocol
Discussion
ऊपर वर्णित विधि छोटे सेल सबसेट या एक 3 progenitors lipophilic रंजक देने के लिए एक पहले से वर्णित तकनीक के एक संशोधन है. यह मानक electroporation तकनीक पर तीन मुख्य लाभ है. सबसे पहले, यह लक्ष्य ऊतकों में विश्वास असतत साइटों के स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम न्यूरल ट्यूब छवि के लिए Shlomi Krispin धन्यवाद. विशेष रूप में, हम GFP अभिकर्मक तकनीक की शुरुआत के लिए Yuval दालचीनी स्वीकार करते हैं. इस काम में इसराइल विज्ञान फाउंडेशन, एसोसिएशन Francaise contre les myopathies, और ड्यूश Forschungsgemeinshaft, सहयोगात्मक अनुसंधान केन्द्र 488 से सी.के. अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. . Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
