Cella Transfection singola in embrioni di pollo
Summary
Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.
Abstract
Un tema centrale in biologia dello sviluppo è la diversificazione delle linee e la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base. Ciò comporta un'analisi approfondita dei destini di singole cellule in condizioni normali e sperimentali. A tal fine, i metodi di trasfezione che l'obiettivo progenitori singole sono un prerequisito. Descriviamo qui un metodo tecnicamente semplice per trasfezione singole cellule nei tessuti pollo in-ovo, permettendo lignaggio tracciamento affidabile così come la manipolazione genetica. Domini tessuto specifici sono mirati all'interno del somite o tubo neurale, e il DNA è iniettato direttamente nel epitelio di interesse, con conseguente trasfezione sporadici di singole cellule. Utilizzando i giornalisti, le popolazioni clonale può quindi essere fatta per un massimo di tre giorni, e il comportamento delle popolazioni geneticamente manipolati clonale può essere paragonata a quella dei controlli. Questo metodo sfrutta l'accessibilità del embrione di pollo con strumenti emergenti per la manipolazione genetica. Noi confrontare e discutere i vantaggi rispetto al metodo ampiamente utilizzato elettroporazione, e le possibili applicazioni e l'uso in ulteriori in-vivo i modelli sono inoltre suggerito. Noi sosteniamo l'utilizzo di questo metodo come un'aggiunta significativa e complemento per lignaggio tracciamento e gli strumenti esistenti interferenze genetiche.
Protocol
Discussion
Il metodo descritto sopra è una modifica di una tecnica descritta in precedenza per la consegna di coloranti lipofilici a sottoinsiemi di cellule piccole o progenitori singolo 3. Ha tre vantaggi principali rispetto alla tecnica standard di elettroporazione. In primo luogo, fornisce un mezzo per l'etichettatura con siti discreta fiducia nei tessuti bersaglio, consentendo maggiore risoluzione spaziale di elettroporazione (vedi ad esempio Figura 1B, C). In secondo luogo, permette l'etichettatura delle s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Shlomi Krispin per l'immagine del tubo neurale. In particolare, noi riconosciamo Yuval Cannella per l'avvio della tecnica di transfezione GFP. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation, Association Francaise contre les Myopathies e Forschungsgemeinshaft Deutsche, Centro di Ricerca in collaborazione da 488 a CK
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
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