Transfecção única célula em embriões de galinha
Summary
Usando ponta fina micropipetas injetamos DNA plasmídeo em subdomínios de somitos frango ou tubos neural. A concentração do plasmídeo é ajustada para gerar única células transfectadas. Em seguida, permitir que as células de se transformar em populações clonais.
Abstract
Um tema central em biologia do desenvolvimento é a diversificação de linhagens ea elucidação dos mecanismos subjacentes molecular. Isto implica uma análise profunda dos destinos de uma única célula em condições normais e experimentais. Para este fim, métodos de transfecção que visam única progenitores são um pré-requisito. Descrevemos aqui um método tecnicamente simples para transfecting células individuais em tecidos de frango in-ovo, permitindo que a linhagem confiável de rastreamento, bem como a manipulação genética. Domínios tecidos específicos são direcionados dentro do somito ou tubo neural, e DNA é injetado diretamente no epitélio de interesse, resultando em transfecção de células individuais esporádicos. Usando repórteres, populações clonais pode conseqüentemente ser seguido por até três dias, e comportamento de populações geneticamente manipulados clonal pode ser comparada com a de controles. Este método aproveita a acessibilidade do embrião de galinha juntamente com ferramentas emergentes para a manipulação genética. Nós comparar e discutir suas vantagens sobre o método de eletroporação amplamente utilizado, e possíveis aplicações e uso em mais in-vivo modelos são também sugeridas. Defendemos o uso deste método como um acréscimo significativo e complementar para os actuais linhagem rastreamento e ferramentas de interferência genética.
Protocol
Discussion
O método descrito acima é uma modificação de uma técnica descrita anteriormente para a entrega de corantes lipofílicos para subpopulações de células pequenas ou progenitores única 3. Ele tem três grandes vantagens sobre a técnica de eletroporação padrão. Primeiro, ele fornece um meio para a rotulagem com sites de confiança discretas em tecidos-alvo, permitindo maior resolução espacial do que eletroporação (ver, por exemplo, Figura 1B, C). Segundo, que permite a rotulagem de uma única cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Shlomi Krispin para a imagem do tubo neural. Em particular, reconhecemos Yuval canela para iniciar a técnica de transfecção GFP. Este trabalho foi financiado por concessões do Ciência Israel Foundation, Francaise Associação Miopatias contre les, e Forschungsgemeinshaft Deutche, Centro de Pesquisa Colaborativa 488 CK
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
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