Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon
Summary
Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.
Abstract
Gelişimsel biyoloji merkezi bir tema soyları çeşitlendirilmesi ve altta yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması. Bu normal ve deneysel koşullar altında tek hücre kaderi ayrıntılı bir analiz gerektirir. Bu amaçla, tek atalarıdır hedef transfeksiyon yöntemleri bir önkoşuldur. Biz burada, yanı sıra genetik manipülasyon izleme güvenilir soyu, tavuk-ovo dokuların tek hücre transfecting sağlayan bir teknik olarak basit bir yöntem açıklanmaktadır. Özgül doku etki hücre gruplarının ya da nöral tüp içinde hedeflenen ve DNA tek hücre sporadik transfeksiyon ilgi epitel içine doğrudan enjekte edilir. Gazetecilere kullanarak klonal popülasyonları dolayısıyla üç gün için takip edilebilir ve genetik olarak manipüle klonal popülasyonlarının davranış kontrolleri ile mukayese edilebilir. Bu yöntem, genetik manipülasyon için yeni araçlar ile birlikte civciv embriyo erişilebilirlik yararlanır. Biz karşılaştırın ve yaygın olarak kullanılan elektroporasyon yöntemi daha fazla avantaj ve olası uygulamaları tartışmak ve ek in vivo modellerde de önerilmektedir. Biz mevcut soy izleme ve genetik etkileşim araçları için önemli bir ek ve tamamlayıcı olarak bu yöntemin kullanılmasını savunan.
Protocol
Discussion
Yukarıda açıklanan yöntem, küçük hücre alt grupları veya tek atalarıdır 3 lipofilik boyalarla teslim için önceden açıklanan teknik bir değişiklik . Bu standart elektroporasyon tekniği üzerinde üç ana avantajı vardır. İlk olarak, elektroporasyon daha yüksek uzaysal çözünürlük (C, örneğin Şekil 1B) sağlayan, hedef dokular olan güveni ayrık siteleri ile etiketlenmesi için bir araç sağlar. İkincisi, bu nedenle, normal koşullar 1 2 (Şekil 1C, D) altında in<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Shlomi Krispin nöral tüp görüntü için teşekkür ederiz. Özellikle, GFP transfeksiyon tekniği başlatmak için Yuval Tarçın kabul etmiş sayılırsınız. Bu çalışma, CK, İsrail Bilim Vakfı, Derneği Francaise contre les Miyopatiler, ve Deutche Forschungsgemeinshaft Arastırma Merkezi 488 hibe tarafından desteklenen
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. . Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
